亲和层析法纯化华支睾吸虫抗原的研究

目的探索华支睾吸虫特异性抗原的纯化方法。方法从华支睾吸虫病流行区的淡水鱼中分离华支睾吸虫囊蚴,接种动物,收集成虫,制备匀浆液(粗抗原),借助偶联华支睾吸虫病人血清抗体的Sepharose4B亲和层析柱,提取特异性抗原,用浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(CG-PAGE)和免疫印迹方法鉴定纯化抗原的纯度和特异性。结果亲和层析法纯化抗原经CG-PAGE显示5条蛋白带,免疫印迹试验鉴定均有抗原性,强阳性带蛋白分子质量单位为31ku,各区带蛋白与并殖吸虫、血吸虫血清抗体无交叉反应。粗抗原有16条蛋白带。结论经亲和层析法纯化的华支睾吸虫抗原特异性高。亲合层析是获取华支睾吸虫诊断用抗原的较佳方法。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

两种方法纯化的抗体筛选华支睾吸虫模拟抗原表位的比较

目的比较用不同方法纯化的IgG从噬菌体随机12肽库中筛选出的华支睾吸虫模拟抗原表位。方法用饱和硫酸铵沉淀法和饱和硫酸铵沉淀法加层析法(两步法)纯化提纯的华支睾吸虫病患者血清IgG筛选华支睾吸虫模拟抗原表位,扩增随机挑取噬菌斑并进行序列分析和免疫学鉴定。结果硫酸铵沉淀法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,6个有不同的DNA插入序列,Western blot显示6个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。两步法纯化IgG筛选的20个噬菌体克隆,9个有DNA插入序列,其中有2个序列相同;Western blot和斑点免疫金银染色法显示9个克隆均可与华支睾吸虫患者血清反应。结论两种方法纯化的IgG均筛选到了可与华支睾吸虫患者血清结合的模拟抗原表位,用两步法纯化IgG筛选的模拟抗原表位更具有潜在的诊断价值。     

华支睾吸虫PPMP型抗原基因的克隆、表达与免疫原性鉴定

目的筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找和鉴别新颖的抗原基因,并分析其重组蛋白的免疫原性方法以华支睾吸虫病患者混合血清免疫筛选华支睾吸虫成虫λZAP cDNA表达文库,将阳性噬菌体克隆、测序,对获得的核苷酸序列进行生物信息学分析。将目的基因成熟肽的编码区克隆至原核表达质粒pET28b(+),转化至大肠埃希菌BLR(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。以纯化的重组蛋白pET28b-Cs2免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,ELISA检测抗体水平。结果共获得44个阳性克隆,其中3个克隆的氨基酸序列中均含有PPMP重复序列,将其命名为华支睾吸虫PPMP型抗原,将其中含有KPPMPGDRDA、QPPMPGGRDA串联重复多肽序列的抗原分别称为PPMPⅠ型和PPMPⅡ型抗原。经核苷酸序列同源性比较,PPMP型抗原是一个新的华支睾吸虫特异性抗原家族。PPMPⅠ型的Cs2基因和PPMPⅡ型的Cs3基因的成熟肽编码区在大肠埃希菌BLR(DE3)或BLR(DE3)pLysS中表达,并获得可溶性重组蛋白,2个重组蛋白的相对分子质量分别为M_r 22 000和M_r 39 000。重组蛋白可被华支睾吸虫病患者血清所识别。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度(1:64000)特异性IgG抗体。结论发现华支睾吸虫PPMP型抗原基因家族,其重组蛋白具有较强的免疫原性。     

华支睾吸虫NOSIP基因的克隆表达及免疫学鉴定

目的对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白(CsNOSIP)进行克隆和原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法从华支睾吸虫基因文库中获得CsNOSIP的全长cDNA并克隆至原核表达质粒pET-30a(+)中,诱导表达后用亲和层析柱进行纯化,用纯化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以获得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鉴定重组蛋白CsNOSIP的表达及其反应原性;采用ELISA检测rCsNOSIP免疫小鼠血清特异性抗体亚类水平。结果 CsNOSIP基因的开放阅读框(ORF)包含867 bp,编码288个氨基酸,PCR、双酶切及DNA测序表明pET-30a(+)-CsNOSIP重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,表达产物相对分子质量为35×10~3;经亲和层析法获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可被His单抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染华支睾吸虫小鼠血清及ESP免疫血清识别,重组蛋白免疫血清能识别CsESP;ELISA检测显示rCsNOSIP免疫小鼠血清特异抗体滴度为1∶25 600,以IgG1水平较高。结论 CsNOSIP可在原核表达系统中呈现高效可溶性表达,且具有抗原性,是华支睾吸虫分泌排泄抗原(CsESP)之一,免疫小鼠后可获得高滴度的特异性抗体,抗体亚类以IgG1为主,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的 探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值。方法 以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No．AF093242，简称CysB)的部分基因片段，亚克隆到pTrcHis表达载体，转化入大肠埃希菌DH5α。表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清，评价其诊断应用价值。结果 成功克隆与表达CysB基因片段，纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96．0％(48／50)，与其他寄生虫病的总交叉反应为3．8％(1／26)，而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88．0％(44／50)．与其他寄生虫感染血清无交叉反应。结论 重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性，有希望成为可溶性粗抗原的替代之一。     

华支睾吸虫天然蛋白的纯化及其在免疫诊断中应用

已从华支睾吸虫粗抗原中纯化获得多种纯化抗原,其中部分纯化抗原已初步应用于华支睾吸虫病免疫诊断。本文就华支睾吸虫纯化抗原的纯化方法、免疫诊断效果及应用前景作一综述。     

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）与华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）,以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。     

华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原的免疫印迹分析

目的 寻找华支睾吸虫成虫抗原中具有特异性诊断价值的抗原组分。方法 应用SDS—PAGE和Westernblot分析华支睾吸虫成虫未脱脂、脱脂的可溶性抗原蛋白组分的血清学反应特征。结果 未脱脂成虫抗原有14条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、170、100、67、41、37、35、32、26ku是主带，180、170、37、35ku条带还可与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应。脱脂成虫抗原有10条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、100、67、37、35、24、20ku是主带，此外，180ku带可与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应，78ku带可以与血吸虫病病人血清发生交叉反应。结论 华支睾吸虫成虫抗原经脱脂处理后可减少与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清交叉反应的蛋白组分数量。华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原中主要的特异性抗原组分分别是100、67、41、32、26ku和100、67、37、35、24、20ku，这些组分抗原可用于华支睾吸虫病的免疫诊断。     

华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因表达与在ELISA诊断上的应用研究

目的探讨重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫病血清学诊断上的应用价值. 方法以成虫cDNA为模板PCR扩增GenBank中一个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(No. AF093242,简称CysB)的部分基因片段,亚克隆到pTrcHis表达载体,转化入大肠埃希菌DH5α.表达出的重组蛋白经亲合层析纯化后用于ELISA检测华支睾吸虫及其他寄生虫感染血清,评价其诊断应用价值. 结果成功克隆与表达CysB基因片段,纯化后的重组蛋白用于华支睾吸虫病诊断的敏感性达96.0%(48/50),与其他寄生虫病的总交叉反应为3.8%(1/26),而对比实验中可溶性粗抗原(CAA)用于检测的敏感性为88.0%(44/50),与其他寄生虫感染血清无交叉反应. 结论重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)用于ELISA诊断技术具有较高的敏感性及特异性,有希望成为可溶性粗抗原的替代之一.     

快速微量Dot—IGSS检测日本血吸虫病人血清中抗体的研究

本文用日本血吸虫可溶性虫卵抗原点于微孔滤膜上,以快速微量斑点免疫金银染色法(Rapid microvolume Dot-IGSS,Rm Dot-IGSS)检测血吸虫病患者血清中相应抗体,并与Dot-IGSS相比较,检测血吸虫病人血清69份,两法阳性率均为100％。检测正常人血清50份,两法阴性率均为100％。检测华支睾吸虫病人血清10份,两法均未出现交叉反应。检测肺吸虫病人血清10份,Rm Dot-IGSS未出现交叉反应,Dot-IGSS有1例出现交叉反应。     

ELISA检测肺吸虫病和肝吸虫病患者血清中总IgE水平

应用ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法检测了肺吸虫病和肝吸虫病各３５例患者血清中总ＩｇＥ水平。结果表明，肺吸虫病、肝吸虫病患者和正常献血员血清中总ＩｇＥ含量分别为１０４０．００ＩＵ／ｍｌ、９９１．１４ＩＵ／ｍｌ及２５１．３０ＩＵ／ｍｌ。说明在这两种寄生虫病的发病过程中，虫体释放的可溶性抗原能够诱导机体的免疫活性细胞产生ＩｇＥ；亦证明以皮内试验诊断本病具有理论依据。     

华支睾吸虫成虫抗原免疫酶染色试验和间接免疫荧光抗体试验效果的比较

应用成虫冰冻切片抗原作免疫酶染色试验(IEST)及间接免疫荧光抗体试验(IFAT),对比检测了 51份华支睾吸虫病患者和 50份健康人血清,两法的阳性率分别为 92％和 88％;假阳性率分别为 2％和4％,应用 IEST和IFAT对比检查 22份急性血吸虫病患者血清、20份慢性血吸虫病患者血清及 15份并殖吸虫病患者血清。IEST 出现的交叉反应率分别为 14％、5％和0;IFAT出现的交叉反应率分别为 14％、10％和0。表明两法诊断华支睾吸虫病均有较高的敏感性和特异性,并且抗原定位好。而 IEST不需要特殊仪器,更适合于现场应用。     

Chlamydia pneumoniae replicates in Kupffer cells in mouse model of liver infection

INTRODUCTIONChlamydia pneumoniae(C.pneumoniae)is a common cause of respiratory infections in humans[1,2],and it is also associated with outcomes other than respiratory disease,including coronary heart disease and myocardial infarction[3,4].Systemic diseas…     

酶联免疫吸附试验诊断华支睾吸虫病初步观察

实验感染兔取成虫制成1％华支睾吸虫成虫可溶性抗原。以1:1500包被ELISA板诊断华支睾吸虫病人血清,与粪检阳性符合率88.1％,健康人血清阴性符合率97.1％。用滤纸干血代替血清阳性符合率为87.0％,阴性符合率为85.4％,而在非流行区人群采滤纸干血阴性符合率则为95.1％。与丝虫病人血清未见交叉反应;与疟疾的交叉反应为3％;与血吸虫病的交叉反应为6.66％。结果表明应用ELISA诊断华支睾吸虫病是一种敏感性高、特异性强、重现性良好的免疫诊断方法,现场应用滤纸干血方法简便、微量,值得推广。     

Factor VIII (Antihaemophilic Factor) in Tissues Detected by Antibody Neutralization

S ummary . Antibody to factor VIII was obtained from the plasma of patients with potent inhibitors and by immunizing rabbits with concentrated factor VIII. This was prepared by cryoprecipitation of normal plasma, treatment with Arvin, chromatography on sepharose 6B and ultrafiltration. Various tissues were washed, homogenized and examined for factor-VIII antigen by determining their ability to neutralize the activity of inhibitor or antisera. Factor-VIII antigen was consistently derected in relatively large amounts in human spleen and kidney homogenates and less consistently in the liver. None was found in homogenates of brain and lung and only small and variable quantities were found in other human tissues tested.