脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7d和14d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14d后细胞在支架材料上的生长状况。结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义（P〈0.05）,诱导14d与诱导7d相比,差异亦有显著性意义（P〈0.05）。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。     

脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损

背景:小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关.目的:观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效.方法:36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损.空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物.结果与结论:X射线片测量结果:16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).胫骨长度差值空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).苏木精-伊红染色显示:16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合.提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨.     

脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损

背景：小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关。目的：观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效。方法：36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损。空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物。结果与结论：X射线片测量结果：16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组〉小肠黏膜下层支架组〉脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组（P均〈0.05）。胫骨长度差值空白组〉小肠黏膜下层支架组〉脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组（P均〈0.05）。苏木精-伊红染色显示：16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合。提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨。     

家兔脂肪基质干细胞的分离培养及多向分化诱导

背景:脂肪基质干细胞在人体皮下脂肪中储备充足,体外能快速增殖,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点.目的:体外分离培养家兔脂肪血管基质部分细胞,并验证其具有多分化潜能.方法:体外分离家兔脂肪血管基质部分细胞,在标准条件下培养,流式细胞仪检测第3代血管基质部分细胞表面标记物CD44,CD29,CD45,取第3代血管基质部分细胞进行成脂、成骨、成软骨诱导,油红O染色鉴定成脂诱导,碱性磷酸酶染色、茜索红染色,Von kossa染色鉴定成骨诱导,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Ⅱ型胶原mRNA RT-PCR检测鉴定成软骨诱导.结果与结论:原代血管基质部分细胞为短梭形和多角形,第3代血管基质部分细胞为长梭形,流式细胞仪检测提示CD44+,CD29+,CD45,成脂诱导组,染色油红O阳性,成骨诱导组,碱性磷酸酶染色、Vonkossa染色、茜素红染色阳性,成软骨诱导组,诱导14 d Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阿利新蓝染色阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA显示产物条带较未诱导前信号明显增强.提示体外分离培养的家兔血管基质部分细胞具有干细胞表型,具有向成骨、软骨、脂肪细胞分化的能力,初步鉴定为脂肪基质干细胞.     

脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化

目的:应用转化生长因子β1,体外诱导脂肪干细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2005-04/2006-06在华中科技大学同济医学院公卫实验室完成。①取大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离、培养脂肪干细胞,体外传代培养。②取第3代细胞通过转化生长因子β1、地塞米松和维生素C诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。③诱导后14d观察细胞形态变化,进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原的表达,采用Western-blot和反转录-聚合酶链反应检测诱导前后成软骨相关的Sox9,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞接种的最初几日,细胞呈圆形,1周后贴壁细胞呈长梭形,体积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14d后多数细胞呈平坦的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。②诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中。③免疫组织化学染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。④反转录-聚合酶链反应检测成软骨相关的Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。⑤Western-blot印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论:脂肪干细胞在特定培养液的诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的细胞来源。     

脂肪干细胞与小肠黏膜下层构建仿生骨膜的体内成骨

背景：脂肪干细胞与小肠黏膜下层两者具有良好的组织相容性,但将二者复合构建仿生骨膜修复骨缺损的效果如何尚需进一步验证。目的：探讨以小肠黏膜下层为支架材料复合成骨诱导的脂肪干细胞构建仿生骨膜,体内成骨的可行性。方法：取兔腹股沟区的脂肪分离培养脂肪干细胞经成骨诱导后,与猪小肠黏膜下层复合体外培养3周,构建仿生骨膜。将仿生骨膜埋置于裸鼠皮下,并以小肠黏膜下层复合未成骨诱导的脂肪干细胞的复合材料置于裸鼠皮下做对照。结果与结论：兔脂肪干细胞经成骨诱导后与小肠黏膜下层体外复合培养,见两者黏附良好,细胞分泌大量的细胞外基质。植入4,8,12周组织学和透射电镜观察见有大量骨组织形成,未成骨诱导材料复合物组内无成骨细胞。仿生骨膜植入体内8周免疫组织化学测试骨钙蛋白、骨桥蛋白呈阳性反应。提示仿生骨膜植入裸鼠体内后可形成具有良好血运的新生骨组织。     

脂肪干细胞与小肠黏膜下层构建仿生骨膜的体内成骨

背景:脂肪干细胞与小肠黏膜下层两者具有良好的组织相容性,但将二者复合构建仿生骨膜修复骨缺损的效果如何尚需进一步验证.目的:探讨以小肠黏膜下层为支架材料复合成骨诱导的脂肪干细胞构建仿生骨膜,体内成骨的可行性.方法:取兔腹股沟区的脂肪分离培养脂肪干细胞经成骨诱导后,与猪小肠黏膜下层复合体外培养3 周,构建仿生骨膜.将仿生骨膜埋置于裸鼠皮下,并以小肠黏膜下层复合未成骨诱导的脂肪干细胞的复合材料置于裸鼠皮下做对照.结果与结论:兔脂肪干细胞经成骨诱导后与小肠黏膜下层体外复合培养,见两者黏附良好,细胞分泌大量的细胞外基质.植入4,8,12 周组织学和透射电镜观察见有大量骨组织形成,未成骨诱导材料复合物组内无成骨细胞.仿生骨膜植入体内8 周免疫组织化学测试骨钙蛋白、骨桥蛋白呈阳性反应.提示仿生骨膜植入裸鼠体内后可形成具有良好血运的新生骨组织.     

小鼠间充质干细胞三系分化中SOX9与Ⅱ型胶原mRNA的定量

背景：研究表明,软骨中的主要成分Ⅱ型胶原的基因-Col2al在软骨细胞中的表达与SOX9的浓度呈剂量依赖正相关关系。目的：通过成骨、成软骨、成脂肪诱导干细胞分化,分析3种分化过程及不同时期的SOX9与II型胶原mRNA含量的变化,探讨SOX9在不同时空分布的表达规律及与Ⅱ型胶原的相关关系。方法：取4周龄昆明小鼠骨髓间充质细胞,体外培养得到间充质干细胞并传达至第3代,对间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定细胞表型,共分3组每组设3个时间段,通过成骨、成软骨、成脂肪3种诱导培养液对3组细胞进行诱导,另设不进行诱导的细胞作为对照组。分别在诱导3,7,14d后收集提取细胞的总RNA,通过RT-PCR进行SOX9与Ⅱ型胶原的mRNA定量检测,同时对诱导后的细胞进行染色、免疫荧光染色,观察其分化状态及相关统计分析。结果与结论：第3代骨髓间充质干细胞生长良好,流式细胞仪鉴定细胞表型证实为干细胞,对诱导后细胞进行染色、免疫荧光染色结果证实细胞分化为骨、软骨、脂肪细胞。经RT-PCR检测,在3组诱导分化细胞中SOX9mRNA含量由高到低分别是成软骨、成骨、成脂肪,Ⅱ型胶原mRNA含量由高到低分别是成软骨、成脂肪、成骨。在成软骨分化中SOX9在3,7d表达不断升高,14d呈下降趋势。Ⅱ型胶原在3,7,14d均逐渐升高。在成骨分化中SOX9mRNA含量随着时间推移而增加,而Ⅱ型胶原则随着时间推移而不断降低。在成脂肪分化中SOX9mRNA表达与对照组比较差异无显著性意义（P〉0．05）;而Ⅱ型胶原的表达没有规律可循,时间点的延伸及检测未观察到。结果提示,SOX9在软骨分化中作用优于成骨、成脂肪组,且软骨分化中SOX9与Ⅱ型胶原存在相关性,可能在软骨分化的早期Ⅱ型胶原随着SOX9的变化而变化;且软骨分化和成骨分化过程中SOX9可能起到了一个互相协调促进平衡的关键作用。     

猪小肠黏膜下层基质支架材料复合脂肪基质干细胞的生物相容性

背景:小肠黏膜下层具有良好的细胞、组织相容性和降解性,是一种理想的组织工程支架材料,将脂肪基质干细胞与小肠黏膜下层复合后进行定向诱导,可构建靶组织,具有一定的临床应用潜能.目的:制备脱细胞猪小肠黏膜下层基质,并检验其与家兔脂肪基质干细胞的生物相容性.方法:使用酶消化-高盐水脱细胞法处理猪小肠黏膜下层,石蜡切片检测脱细胞效果,扫描电镜观察小肠黏膜下层表面结构.体外分离培养家兔脂肪基质干细胞,分别将第3代脂肪基质干细胞单面复合和双面复合至小肠黏膜下层培养1周观察材料上下表面细胞复合情况.结果与结论:小肠黏膜下层材料为白色半透明膜状物,石蜡切片显示细胞去除彻底,扫描电镜显示小肠黏膜下层黏膜结构紧密,浆膜面纤维结构松散.脂肪基质干细胞与材料复合后,通过相差显微镜观察到细胞在小肠黏膜下层上附着生长,扫描电镜检测提示单面复合脂肪基质干细胞的小肠黏膜下层,仅在上表面有大量细胞生长,下表面无细胞或仅有少量细胞生长,双面复合脂肪基质干细胞的小肠黏膜下层上下表面均可见大量细胞融合生长,石蜡切片可见细胞贴附于材料表面生长.提示酶消化-高渗盐水法可彻底去除小肠黏膜下层表面细胞成分,小肠黏膜下层对脂肪基质干细胞的生长具有良好的支持作用.     

小鼠脂肪来源干细胞向成骨及软骨细胞的诱导分化

背景：脂肪干细胞常从脂肪组织中分离获取,脂肪组织在全身均有分布,极易大量获得,取材时对供区损伤小。目的：进一步验证小鼠脂肪来源干细胞的体外分离、培养方法,并在特定条件下诱导其向成骨细胞和软骨细胞分化,探讨其作为组织工程种子细胞的可行性。方法：取昆明种雄性小鼠附睾处脂肪,I型胶原酶消化法和差速贴壁法获取、纯化脂肪干细胞并进行细胞表型鉴定。采用成骨诱导培养基诱导脂肪干细胞,进行钙钴法碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色检测细胞分化情况;采用软骨诱导培养基诱导脂肪干细胞,进行甲苯胺蓝染色,番红O染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学检测细胞分化情况。结果与结论：脂肪干细胞呈梭形贴壁生长,原代7-9d可达90％融合,传至第3代后细胞形态趋向一致,传代的脂肪干细胞生长曲线呈“S”形。细胞特异性抗原测定CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45呈阴性表达。成骨诱导分化后细胞碱性磷酸酶染色和茜素红染色呈阳性。软骨诱导分化后细胞番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色呈阳性。证实从脂肪组织中可分离到具有分化潜能的干细胞,可在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞、软骨细胞,其具有来源广泛,取材方便等优点,可成为组织工程理想的种子细胞。