胰腺干细胞体外培养扩增的方法

背景：胰腺干细胞在体外培养时极易分化,很难获得足够数量的胰腺干细胞。目的：探讨一种简便易行的胰腺干细胞体外扩增培养方法。方法：分离新生昆明小鼠胰腺,原代培养三四天,成纤维细胞中出现呈集落生长的胰腺干细胞后,以0.02%EDTA消减成纤维细胞的数量,降低其比例后继续培养,待细胞铺满培养瓶底的80%时,重复三四次,逐渐提高胰腺干细胞的数量。检测胰腺干细胞特异性标志Nestin。尼克酰胺诱导胰腺干细胞分化;双硫腙染色对胰岛样细胞团进行检测。结果与结论：消减胰腺成纤维细胞的数量及比例后,胰腺干细胞可持续表现出活跃的分裂增殖能力,胰腺干细胞的数量显著增加;细胞保持球形、单个大核、细胞质折光性强、表达（Nestin）。扩增的胰腺干细胞,以尼克酰胺诱导后分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性。提示,减少共培养中成纤维细胞的比例和数量,有利于胰腺干细胞的增殖,获得较多数量的胰腺干细胞。扩增后的胰腺干细胞仍保持未分化状态,在适当的体外诱导条件下能分化为胰岛样结构,具有一定的分化潜能。     

兔脂肪干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞的可行性

背景:胚胎干细胞、胰腺干细胞、肝卵圆细胞、小肠上皮干细胞和骨髓间充质干细胞均可以在体外诱导分化为胰岛β样细胞,那么脂肪干细胞是否也可以呢?目的:探讨兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。方法:以常规方法从兔脂肪抽吸物中分离、培养脂肪干细胞;传2代后,用高浓度葡萄糖(25mmol/L)培养液DMEM以及碱性成纤维生长因子和尼克酰胺诱导兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化。结果与结论:第2代兔脂肪干细胞经过高糖诱导后,细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。说明兔脂肪干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

体外诱导胰腺干细胞向胰岛样细胞团的分化

背景：目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。目的：于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛及鉴定的技术和方法。方法：体外获得纯化的小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂对其进行成胰岛方向的诱导分化,并对诱导形成的胰岛样细胞团进行形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR和Western blot检测。结果与结论：实验通过细胞形态学和细胞生长特性的观察以及免疫细胞化学染色证实体外成功获得了小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂将其诱导成胰岛样结构,呈球形,以较细长的蒂部与瓶底连接,双硫腙染色将其染成铁红色。RT-PCR和Western blot法可分别检测到胰岛样细胞团的胰岛素mRNA和胰岛素蛋白。结果证实小鼠胰腺干细胞可体外诱导分化成含β细胞的胰岛样细胞团。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用.关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道.目的:进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性.方法:采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养:传2代后,用高浓度葡萄糖(2s mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化.倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素.结果与结论:第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团:并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团:免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性.结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌样细胞及其鉴定

背景:体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞,目前尚无成熟的鉴定方案.转基因诱导要求条件高,程序复杂,化学诱导剂诱导为现阶段较多采用的一类方法.目的:探讨成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的条件.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/10在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青岛大学医学院附属医院内分泌科行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者,对治疗及实验均签署知情同意书.表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Peprotech Asia公司产品,B27添加剂为Gibco公司产品,尼克酰胺、2-巯基乙醇、谷氨酰胺、双硫踪为Sigma公司产品.方法:采用Percoll法分离成人骨髓间充质干细胞,加入含体积分数为0.1胎牛血清的LG-DMEM进行培养,胰蛋白酶消化传代.取第3～5代细胞,按1×108 L-1密度接种,分3阶段诱导:第1阶段加入含2-巯基乙醇、谷氨酰胺的HG-DMEM,培养2 d;第2阶段加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂、谷氨酰胺的HG-DMEM,培养6 d;第3阶段加入含尼克酰胺、2-巯基乙醇的HG-DMEM,培养6 d.对照组采用单纯的HG-DMEM进行培养.主要观察指标:相差显微镜下观察细胞形态变化,诱导第2阶段行免疫荧光鉴定PDX-1基因的表达,诱导第3阶段行双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞团,电化学发光法测定低糖/高糖刺激下胰岛素的分泌情况.结果:未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长,诱导后胞逐渐变圆,并聚集成团.诱导8 d细胞PDX-1基因呈阳性表达,诱导14 d细胞团双硫腙染色呈棕红色.经低糖、高糖刺激后,对照组无胰岛素释放,诱导14 d细胞团培养基中胰岛素含量显著升高(t=3.638～9.387,P均 < 0.01).结论:2-巯基乙醇、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及尼克酰胺等可在体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为具有分泌胰岛素功能的胰岛样细胞.     

不同细胞接种浓度影响人脐带间充质干细胞生长及多向分化

背景：在干细胞培养过程中寻找合理的细胞接种浓度,从而得到能稳定、高效生长的干细胞非常重要。目的：观察不同接种浓度对人脐带间充质干细胞原代培养及分化为神经元样、胰岛样、脂肪样细胞的影响。方法：分离人脐静脉内皮及内皮下层细胞,按不同接种浓度分组进行原代培养,记录原代培养时间并进行传代。取第1代人脐带间充质干细胞,体外诱导其向神经元样、胰岛样、脂肪样细胞分化。结果与结论：原代培养发现以5×105～1×106/cm2细胞浓度接种的人脐带间充质干细胞生长状态最佳。经β-巯基乙醇诱导6h,细胞即表达Nestin、神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白;经尼克酰胺,活化素A,胰高血糖素样肽1诱导21d可见明显的胰岛样细胞团,双硫腙染色呈砖红色;经成脂诱导培养基诱导后细胞油红O染色阳性,有明显脂滴出现。可见选取合适的细胞浓度可以快速获得大量的人脐带间充质干细胞,且该细胞经体外诱导可向神经元样、胰岛样及脂肪样细胞分化。     

不同细胞因子组合体外诱导人脐血干细胞向胰岛样细胞分化

背景:由干细胞分化而来的胰岛样细胞存在数量少、胰岛素分泌量少以及能否达到临床移植要求等问题.目的:观察不同细胞因子组合对人脐血干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.材料:脐血来源于足月分娩的健康产妇,由沈阳市德济医院提供.方法:密度梯度离心法体外分离人脐血单个核细胞,诱导1组首先以低糖DMEM培养液进行培养,添加20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子,培养成巢蛋白阳性细胞后改为高糖DMEM培养液,添加2%B27和10 mmol/L尼可酰胺.诱导2组直接以高糖DMEM培养液进行培养,添加20 mmol/L尼可酰胺、20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L肝细胞生长因子、2%B27及0.1 mmol/Lβ-巯基乙醇.对照组只添加与诱导组相同的培养液,不加入任何细胞因子.主要观察指标:诱导分化后对贴壁细胞进行形态学观察、胰岛素抗体的细胞免疫荧光染色及双硫腙染色鉴定.结果:体外培养的人脐血干细胞通过细胞因子组合诱导后,可见散在的胰岛样细胞或成群的胰岛样细胞群,呈Insulin阳性反应.诱导1组细胞散在或成群分布,诱导2组则多为散在分布的胰岛样细胞,且细胞相对较小,几乎没有胰岛细胞团.双硫腙染色后诱导1组有少部分较大的胰岛样细胞呈阴性,诱导2组细胞均呈棕红色阳性表达,未诱导的对照组细胞呈阴性.结论:人脐血干细胞通过不同细胞因子组合诱导后具有向胰岛样细胞分化的潜能,但诱导1组中部分细胞可能是非胰岛索细胞,而诱导2组胰岛样细胞均一性较差,可能与胰岛细胞种类较多、大小不一有关.     

胰岛干细胞转分化胰岛样细胞与天然胰岛功能的比较

目的:目前在胰腺干细胞体外转分化为胰岛样细胞的转化效率,转分化胰岛样细胞的成熟度,能否代替天然胰岛的功能等问题上存在争议.实验将分离纯化、扩增的大鼠胰腺导管上皮细胞,并诱导分化为胰岛样细胞团,与天然胰岛功能进行比较.方法:实验于2004 07/2005-04在暨南大学第二临床医学院暨深圳市人民医院临床医学研究中心实验室完成.实验选用SD大鼠10只,采用差异性贴学、低血清培养等方法纯化大鼠胰腺导管上皮细胞,以免疫组织化学方法鉴定后,在含exendin-4、角质细胞生长因子、尼克酰胺等细胞因子和葡萄糖的培养基中,将其转分化为胰岛样细胞团.以DTZ染色和胰岛素免疫荧光染色鉴定.分离纯化SD大鼠天然胰岛,对胰岛样细胞团与天然胰岛进行葡萄糖刺激试验,检测培养液上清液中胰岛素和C肽的水平.结果:①免疫组织化学染色显示从大鼠胰腺导管上皮细胞分离纯化的细胞呈CK-19染色阳性,PDX-1染色阴性,表明为胰腺干细胞.诱导4周后,细胞逐渐汇聚成胰岛样细胞团,免疫荧光染色为阳性,证明有胰岛索分泌.②葡萄糖刺激实验显示,在低糖和高糖刺激下,胰岛样细胞团胰岛素的分泌量约为天然胰岛的1/30和1/35,C肽分泌量为天然胰岛的1/32和1/26.结论:目前胰腺干细胞体外转分化为胰岛样细胞的成熟度与天然胰岛仍然存在较大差别,其在功能仅为天然胰岛的1/30～1/35.     

体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛样细胞

背景：人脐带间充质干细胞具有获取容易、免疫原性低等优点,目前尚缺乏体外诱导其分化为胰岛样细胞的成熟方案。目的：探讨人脐带间充质干细胞在体外一定条件下分化为胰岛样细胞的可能性。方法：无菌条件下分离培养人脐带间充质干细胞,细胞传3代后,采用两步法诱导其向胰岛样细胞分化：第1步,加入含100pg／L13-神经生长因子,4nmol／LActivinA,10mmol/L尼克酰胺,25pg／L表皮生长因子,体积分数为10％胎牛血清的DMEM／F12培养基中培养7d;第2步,将诱导液换为含10mmoI／L尼克酰胺,10pg／L碱性成纤维细胞生长因子,1％胰岛素一转铁蛋白一硒的DMEM／F12培养基,诱导时间为14d。对照组单纯加入DMEM／F12培养基进行培养。结果与结论：诱导2周后脐带间充质干细胞开始聚集成团,诱导3周后,葡萄糖刺激试验阳性、PDX-1和Insulin基因表达。而对照组细胞无胰岛素分泌,胰岛细胞相关基因表达阴性。实验成功地将脐带间充质干细胞诱导成了胰岛样细胞。     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景:相对于其他来源的干细胞而言,脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小,但并不等同于无任何免疫排斥反应.目的:观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化,及其移植后对槠尿病大鼠的治疗效果.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验窀完成.材料:清洁级雄性SD大鼠36只,随机分为4组:胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只.人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供.方法:取传至第3代的人脐带间充质干细胞,待细胞融合至70%～80%后,换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基,向胰岛样细胞诱导分化.除正常对照组外,其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建屯糖尿病模型.造模后,胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2× 106个,间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞,模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL.主要观察指标:诱导后胰岛样细胞的鉴定,胰岛样细胞的移植效果.结果:诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长;诱导4 d后细胞向中央聚集,出现胰岛样细胞团,此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多;诱导7d双硫腙染色呈阳性表达.移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低,一直维持至第6周;间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降,但4周后皿糖浓度上升;模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内.免疫组化染色结果显示,移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达,间充质干细胞组仪有表达少量胰岛素,正常对照组胰岛素表达无明显变化.结论:人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞.与脐带间充质干细胞相比,胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平,且植入后可迅速发挥降糖作用.     

小鼠胰腺干细胞在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下的体外连续传代培养

背景:胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题.目的:在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成.材料:SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心. 方法:取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,V型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养.取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108L-1接种于24孔板中, 传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞.取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达.分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达. 结果:原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力.在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态. 结论:以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态.     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

背景:以往研究已证明胚胎干细胞可被诱导分化为胰岛素分泌细胞,但诱导时间较长,大部分需要1个月左右.目的:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,观察能否在较短的时间内将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.设计:细胞观察实验.单位:上海市内分泌及代谢病研究所,上海交通大学医学院附属瑞金医院.材料:实验于2004-10/2006-02在上海市内分泌研究所完成.清洁级孕12.5～14.5d龄昆明小白鼠2只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,动物质量合格证号2004A034,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞株由法国里昂CNRSUMR5641实验室张昌贤教授提供.激活素A为R&D公司产品;全反式维甲酸,烟酰胺由Sigma公司提供;碱性成纤维细胞生长因子由Gibco公司提供.方法:取孕鼠胚胎,除去头部和内脏,将剩余组织剪碎,胰酶消化后制备细胞悬液,取上层离心重悬,按3×108L-1接种培养,传2～3代时作为滋养层细胞.将鼠胚胎干细胞接种到新鲜滋养层上,加入含白血病抑制因子的knockout DMEM培养基,常规培养两三天后按1:3～1:6传代,当细胞与细胞之间分开时加入含血清的培养液终止消化,离心弃上清,制成单细胞悬液按2.5×104密度接种,加入不含白血病抑制因子的培养液,24～48h后收集形成的胚胎体,铺于Matrigel铺底的培养皿中.胚胎体贴壁后,在含有100μg/L激活素的10% FBS/DMEM中培养24h,再将培液换为10% FBS/DMEM培养6~8h作为间隔,然后把分化的胚胎体在含10-6mol/L全反式维甲酸的10% FBS/DMEM中培养24h,在含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的10% FBS/DMEM中培养3～5d,在含N2、 B27、1μg/L层粘连蛋白、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10mmol/L烟酰胺的DMEM/F12培液中培养3～5d.诱导结束后,采用双硫腙染色、免疫荧光染色、RT-PCR检测分化细胞胰岛素的表达.主要观察指标:[1]胚胎干细胞的诱导情况.[2]双硫腙染色及免疫荧光染色.[3]RT-PCR检测.结果:[1]滋养层上的小鼠胚胎干细胞呈集落状态贴壁生长,集落边缘清晰,细胞之间的界限不明显.胚胎体形成后转至matrigel板上2d即贴壁.激活素A和全反式维甲酸间歇诱导后,碱性成纤维细胞生长因子培液中的细胞大部分变为上皮细胞样;经含N2、B27、层粘连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺的DMEM/F12培液作用后,细胞形成小的簇状结构.[2]诱导生成的胰岛素分泌细胞经双硫腙染色呈暗红色,免疫荧光染色呈红色,均为阳性反应.[3]经激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、烟酰胺四种生长因子诱导2周后,分化细胞不表达Insulin 1mRNA,表达Insulin 2, Pdx1, Nkx6.1, Nkx2.2, PP, LAPP, Glutt2, Somastatin, Hnf3 β及Neuro D mRNA.结论:体外联合应用激活素A、全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子和烟酰胺4种生长因子,能够将小鼠胚胎干细胞成功诱导分化为胰岛素分泌细胞,且诱导时间缩短至2周.     

胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞

背景: 胰岛移植是治疗1型糖尿病包括部分2型糖尿病的有效方法.然而,供体来源的匮乏及移植免疫排斥反应极大地阻碍了该方法的推广和应用.最有希望的来源是从干细胞诱导分化出大量可供移植的胰岛细胞,但目前胰腺干细胞转分化方面的研究尚处于起步阶段.目的:寻找胰岛移植治疗糖尿病合适的细胞来源.方法:分离培养昆明小鼠胰腺导管上皮细胞,以添加有角化细胞生长因子、肝细胞生长因子和烟酰胺的DMEM/F12培养基培养,不同时间取样本于光镜和电镜下观察,检测第1,16天时CK-19、PDX-1免疫化学染色变化并以半定量RT-PCR检测第1,16天时胰岛素和胰高血糖素基因表达情况,21 d时行双硫腙染色实验及葡萄糖刺激的胰岛素释放实验以检验胰岛样细胞的生理功能.结果与结论:分离第1天,大部分细胞CK-19染色阳性,偶可见PDX-1阳性细胞,16 d后,CK-19阳性细胞快速增殖形成细胞团,大部分细胞PDX-1染色阳性;RT-PCR显示培养细胞胰岛素和胰高血糖素表达明显增强,分别增加了5.4倍和6.1倍(P < 0.01);21 d时胰岛样细胞团更加成熟,双硫腙着色阳性,且对高糖(15 mmol/L)刺激的胰岛素释放较低糖(5.6 mmol/L)时增加了1.6倍(P < 0.05).提示小鼠胰腺导管上皮细胞在体外培养条件下可增殖,并具有干细胞潜能,可转分化胰岛素分泌细胞.     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞,是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源,但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力,诱导分化成需要的表现型,尚处于研究探讨阶段.目的探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件.设计以细胞为观察对象,单一样本研究.单位江西医学院泌尿外科研究所,江西医学院第二附属医院神经外科.材料实验于2003-12/2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成.取16周龄新鲜人胚脑组织.方法用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞,细胞冻存1个月后复苏或/和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养,碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长,用血清诱导其分化;采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达.观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响.主要观察指标①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况.②细胞形态变化.③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定.结果①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞.人胚脑原代细胞为圆形亮球状,培养3d后可见细胞开始聚集成神经球,部分呈悬浮生长,2周后神经球增大,部分细胞增大数倍,具有极强折光性,可见分裂增殖.经传代后细胞仍保持原有特征,细胞形态不变.克隆细胞在有血清培养基中培养,24 h后可见大部分细胞贴壁生长,细胞从神经球游出分散,形态不规则;48 h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞,突起相互交织成网.②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养,并表达神经于细胞标志巢蛋白;含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶.③冻存复苏的细胞95%以上为活细胞,与新鲜细胞比较,细胞生长状况无明显差别.结论用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用,使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化,证实其方法可行,同时冻存和新鲜细胞的比较,说明可用冻存方法保存人胚脑细胞,复苏后使用.     

人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究

目的:利用形态学研究方法,探讨神经干细胞特异性标志蛋白的表达和增殖分化特性,鉴定人类羊膜组织中神经干/前体细胞的存在。方法:利用免疫组织化学法,检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白的表达,利用BrdU掺入实验鉴定羊膜组织来源神经干/前体细胞的增殖分化能力。结果:免疫组织化学检测证实人羊膜组织表达nestin、musashi-1、CD133和vimentin等神经干细胞特异性标志蛋白,主要分布于羊膜组织的间质层。培养羊膜细胞的免疫荧光化学染色显示nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM阳性细胞的存在。BrdU掺入的组织形态学实验显示培养羊膜细胞中存在BrdU标记阳性细胞,其中具有BrdU与nestin、musashi-1、vimentin双标阳性细胞,显示羊膜细胞中存在具有增殖活性神经干细胞标记蛋白表达阳性细胞;而BrdU与β-tubullinIII、TH和GFAP双标阳性细胞的存在,表明神经元和胶质细胞是由培养羊膜细胞增殖分化的。结论:羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin、Musashi-1、CD133、PSA-NCAM和Vimentin表达阳性细胞,BrdU掺入的组织形态学结果不仅证实羊膜细胞中Nestin、Musashi-1、Vimentin阳性细胞具有增殖活性,而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞,提示羊膜组织细胞内存在神经干/前体细胞。     

豚鼠脂肪间充质干细胞:一种适用于耳科实验研究的理想干细胞

背景:目前关于耳科干细胞研究的动物实验大多是将其他动物种属的干细胞用于豚鼠模型,而对于豚鼠本身来源的干细胞研究报道极少。目的:观察豚鼠脂肪间充质干细胞成骨、成脂肪、成神经细胞分化的潜能,并探讨其应用于耳科实验的可能。方法:取豚鼠脂肪,分离脂肪间充质细胞培养至第3代,检测第1～10天细胞增殖吸光度值;流式细胞仪检测细胞的免疫表型;并行成骨细胞诱导、成脂肪细胞诱导、成神经细胞诱导及鉴定。结果与结论:脂肪间充质细胞增殖的生长曲线近似"S"形,传代后经过3d的潜伏期,4d进入对数生长期,8d进入平台期;锥虫蓝染色细胞拒染率94%～98%,从P0～P5细胞的总产量扩增了约3600倍;其细胞免疫表型CD29表达率86.3%,CD44表达率55.5%,CD45表达率为0.4%。成骨细胞诱导后经特异性染色可见矿化结节形成;成脂肪细胞诱导后经油红O染色胞浆内可见脂质滴;成神经细胞诱导后细胞形态与神经细胞类似,Nestin、GFAP、NF200染色均呈阳性。提示豚鼠脂肪间充质细胞在体外易于分离、培养及扩增,具有间充质干细胞的"干性",是一种适用于耳科实验研究的理想干细胞。     

人胎脑皮层神经干细胞的体外培养及鉴定

目的 从36周人胎脑皮层分离培养神经干细胞并鉴定。方法 采用无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能,采用免疫组化和免疫荧光技术检测克隆细胞的神经巢蛋白和各种分化细胞的特征性抗原的表达。结果 从36周人胎脑皮层中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养时神经干细胞分化,并表达神经元细胞和星形胶质细胞的特异性抗原。结论 36周人胎脑皮层仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

小鼠精原干细胞体外培养诱导成骨的能力

背景：精原干细胞具有自我更新及多向分化潜能,并可将其体外定向诱导为特异性细胞,提示精原干细胞亦可能具有向成骨细胞转化的可能性,但有关这方面的研究尚未见报道。目的：观察小鼠精原干细胞在体外成骨细胞培养条件下的生物学特征变化。方法：取生后15-20 d小鼠胫骨骨髓,分离、培养骨髓基质细胞,5 d后丝裂霉素C处理制备成饲养层;取生后七至八天小鼠睾丸,经酶消化后制成单细胞悬液并接种于饲养层上。3 d后实验组和对照组分别用条件培养液和基本培养液进行诱导培养,通过倒置相差显微镜观察培养细胞生长状况及形态变化,并结合碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色等方法进行结果检测。结果与结论：实验组精原干细胞在条件培养液中较对照组细胞贴壁生长快,条件培养3-6 d后见细胞生长迅速,呈集落样增长,细胞立体感增强,细胞团、簇的大小继续增加,细胞外基质增多,但未见明显细胞间桥。培养15 d后,对两组细胞进行碱性磷酸酶染色可见胞质、胞膜染为黑色,呈阳性。在荧光显微镜下可见实验组细胞浆内出现绿色荧光,呈阳性荧光反应;对照组细胞呈阴性反应,说明实验组细胞Ⅰ型胶原染色阳性,这与成骨细胞的生物学特性相似。提示精原干细胞在一定的诱导条件下具有成骨能力,有望为骨组织工程学研究提供种子细胞。