腺相关病毒介导的小鼠Ⅸ因子在血友病B小鼠体内表达研究

通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>10¹²)的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒, 并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中, 获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370 ng/mL), 持续时间超过350 d. 治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常值的30%, 而且出血症状得到显著改善. 在小鼠血浆中未发现抗Ⅸ因子的中和抗体, 第1次注射后抗AAV抗体的水平也非常低. 重复注射AAV/mFⅨ病毒后, 不同剂量组的小鼠体内的抗AAV抗体出现了不同的结果. 组织分析结果证实了血浆中有功能的FⅨ因子确实来源于骨骼肌. 以上结果显示, AAV介导的基因转移是血友病B基因治疗的极有前途的方法.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

AAV介导的hFⅨ基因在血友病B小鼠骨骼肌中特异性表达研究

采用重组腺相关病毒(rAAV)介导人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)微基因在Ⅸ因子基因剔除小鼠骨骼肌中有效表达.在构建的质粒中,rAAV两侧反转重复末端顺序中插入肌酸肌酶增强子(MCK)和β肌动蛋白启动子(βA)调控下的hFⅨ微基因(hFⅨm1).直接肌肉注射高滴度rAAV(2.5×1011/mL),血友病B小鼠血浆hFⅨ最高表达量256ng/mL,凝血活性明显改善.从hFⅨ表达时效曲线来看,hFⅨ水平在第15天达到高峰,随后因血循环中抗hFⅨ抗体的出现而渐次下降.该结果提示采用rAAV系统,体内直接途径开展血友病B基因治疗是值得进一步探索的方向.     

重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术, 将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因, 并构建于AAV载体上, 以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒, 然后, 经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验, 观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果. 结果显示: (i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在, 并持续15周以上; (ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%, 显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%); (iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在; (iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用. 提示: 以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFIX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

微小腺病毒介导的人凝血因子IX基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应,延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间,制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ,同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照。经CsCl超离心纯化,AdGTi‘Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8％。分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞,hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3)μg/(10~6·24h)和(1.4±0.2)μg/(10~6·24h)。血友病B小鼠分别腹腔注射1×10~(10)pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ,小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690ng/mL,表达时间分别持续了16和10周。与血友病B小鼠相比,出血时间从原来的超过30min缩短到7.5min,5min内失血量从原来的430μL减少到60μL。免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明,微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比,在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低。结果表明,微小腺病毒与第1代腺病毒相比,同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达,而且在动物体内的表达时间上有所延长,病毒引起的免疫反应强度则明显降低,为进一步的研究提供了实验依据。     

肌注腺伴随病毒基因治疗血友病B的安全性研究

研究了肌注腺伴随病毒（adeno-associated virus,AAV）介导凝血Ⅸ因子基因治疗血友病B的安全性,道德采用PCR、反转录PCR（RT－PCR）分别检测rHSV/AAV包装系统产生的重组腺伴随病毒AAV－mFⅨ,和病毒感染细胞后所得上清再次感染的BHK细胞中的HSV（herpes simplex virus,HSV)和野生型AAV。同时观察HSV引起的细胞毒作用。结果表明：纯化后的AA－mFⅨ中HSV≤1个病毒基因组（viral genome,v.g.)/10^8个病毒基因组AAV－mFⅨ,且不具备感染活性;没有野生型AAV。其次,采用PCR、RT－PCR1免疫组化等方法检测了AAV－mFⅨ在体内的分布和表达时间;通过抗AAV的抗体检测和病理切片等方法观察了AAV－mFⅨ在体内引起的免疫反应和病理变化。结果表明：AAV－mFⅨ仅分布在注射点肌肉组织内,表达可持续200天以上;抗体水平低,各主要脏器均未发生明显的病理变化。AAV介导的凝血因子Ⅸ系统是安全的。     

腺相关病毒载体基因治疗的研究进展

腺相关病毒 (ＡＡＶ)属于病毒中最小、也是最简单的一种———细小病毒属 ,它是一种有缺陷的非致病性的人类细小病毒 ,重组的腺相关病毒 (ｒＡＡＶ)作为基因治疗的载体 ,对长期基因矫正和基因治疗具有优越性。新的生产工艺提高了ｒＡＡＶ的滴度 ,去除了腺病毒的污染 ,并构建了适用于不同靶细胞的可诱导载体。这些改进有望加速进一步的动物实验研究 ,使临床治疗人类疾病早日成为可能。1 .ｒＡＡＶ的制备方法在 1 989年 ,首次产生了没有野生型ＡＡＶ帮助复制的重组的ＡＡＶ ,这以后 ,为了增加病毒颗粒数 ,人们制造了许多ＡＡＶ辅助质粒 ,其中…     

重组腺相关病毒：很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.     

自身互补型腺相关病毒载体发展趋势

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)可以作为基因运载工具将目的基因运送入靶器官并对多种疾病发挥治疗作用。以rAAV为载体进行基因治疗的关键是病毒基因组由单链变为双链,否则不能适时、有效表达目的基因。自身互补型rAAV(scrAAV)载体基因组本身以双链形式存在,与常规的单链rAAV(ssrAAV)载体相比,无论在表达时间还是表达强度上都有十分明显改善,可显著降低在疾病治疗过程中由于载体本身所诱发的免疫反应。目前,scrAAV已经在肝脏疾病、中枢神经系统疾病、眼部疾病、干细胞修饰以及RNA干扰、核酶技术等领域得到应用。以下在介绍scrAAV载体构建、表达、定位的基础上,以血友病B为主要对象,阐述scrAAV的应用潜力及发展趋势。     

微小腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ基因治疗血友病B小鼠研究

为了降低腺病毒的免疫反应, 延长人凝血因子Ⅸ基因在动物体内的表达时间, 制备了带有人hFⅨ小基因的微小腺病毒AdGTi’Ⅸ, 同时制备了带有人hFⅨ小基因的第1代腺病毒AdSPi’Ⅸ作为对照. 经CsCl超离心纯化, AdGTi’Ⅸ中辅助腺病毒比率低于0.8%. 分别用AdSPi’Ⅸ和AdGTi’Ⅸ以MOI为50的比例感染3T3细胞, hFⅨ表达量分别为(1.6±0.3) μg/(10⁶∙24 h)和(1.4±0.2) μg/(10⁶∙24 h). 血友病B小鼠分别腹腔注射1×10¹⁰ pfu/只的AdGTi’Ⅸ和AdSPi’Ⅸ, 小鼠血浆中人FⅨ表达水平最高分别为590和690 ng/mL, 表达时间分别持续了16和10周. 与血友病B小鼠相比, 出血时间从原来的超过30 min缩短到7.5 min, 5 min内失血量从原来的430 μL减少到60 μL. 免疫组化和抗Ad-IgG分析的结果表明, 微小腺病毒AdGTi’Ⅸ与第1代重组腺病毒AdSPi’Ⅸ相比, 在宿主体内引起的免疫反应强度明显降低. 结果表明, 微小腺病毒与第1代腺病毒相比, 同样能够介导外源基因在离体细胞和动物体内高效表达, 而且在动物体内的表达时间上有所延长, 病毒引起的免疫反应强度则明显降低, 为进一步的研究提供了实验依据.     

血友病AAV载体基因治疗研究进展

血友病基因治疗经过30年的持续发展,已取得长足的进步。血友病患者FVIII或FIX水平达到正常甚至治愈已成为可能。虽然在多个国家血友病基因治疗已取得显著成果,但仍然有很大的改进空间。目前临床试验中AAV是血友病基因治疗的主要载体,未来的研究将集中在完善病毒衣壳、转基因和启动子的设计上,以追求更高的转导效率、更低的免疫反应和可预测性的治疗结果。目前的研究表明,与在动物模式中近乎100%的高转导效率相比,在人类肝细胞中实现高转导效率及凝血因子的高表达仍有不足之处,需要避免蛋白质过载引起的细胞应激风险。虽然血友病基因治疗面临一定的挑战,但是随着技术的不断发展成熟,相信未来会开发出真正治愈血友病的个体化治疗方案。     

腺相关病毒载体与中枢神经系统的基因治疗

本文对ＡＡＶ的分子生物学结构,重组和其对细胞的整合及ｒＡＡＶ载体在基因治疗中的作用,尤其是ｒＡＡ载体在中枢神经系统疾病基因方面的最新应用作了较全面阐述。     

重组腺伴随病毒载体介导的hEPO转移及表达

为实现人促红细胞生成素 (humanerythropoietin ,hEPO)基因在体内的持续表达 ,构建了携带hEPO的重组腺伴随病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体质粒 ,建立了稳定携带hEPO表达盒的rAAV载体细胞株 ,采用“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的rAAV生产策略 ,制备并纯化了携带hEPO的rAAV(rAAV hEPO)。结果表明 ,rAAV介导的hEPO转移能够使hEPO在培养的BHK 2 1细胞中得到有效表达 ;用rAAV hEPO对Balb/c小鼠进行一次肌肉注射 ,可使hEPO在小鼠体内持续表达 10周以上 ,并可明显升高小鼠的红细胞比容     

重组腺相关病毒载体在肝疾病基因治疗中的应用及局限性

基因治疗(gene therapy)是近十年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术.重组腺病毒伴随病毒是一种具有开发潜质的病毒载体,因此近年来对它的研究很是受人关注.肝炎、肝硬化、肝癌在我国乃至全世界是严重损害人们的健康,据此,国内外的研究人员对rAAV在肝疾病基因治疗方面做了大量的工作,本文对rAAV在肝疾病基因治疗中的应用和局限性研究进行综述.     

腺相关病毒载体介导siRNA抑制HBV的表达与复制

目的：构建并制备能够有效抑制HBV mRNA表达的siRNA重组腺相关病毒。 方法：将筛选到的siRNA片段克隆入骨架质粒pAAVMCS中,与pAAVRC和pHelper质粒共转染人胚肾293T细胞,包装出重组腺相关病毒,将纯化后的重组病毒直接感染Hep G 2.2.15细胞,通过酶联免疫法和荧光定量PCR法检测重组腺相关病毒的抑制效果。结果：重组腺相关病毒显著降低HBV 分泌的相关抗原蛋白以及DNA和RNA水平。结论：重组腺相关病毒载体介导的siRNA能够有效抑制HBV的表达与复制。     

降低重组腺相关病毒载体免疫反应的策略

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体在基因治疗研究中应用广泛,但可能引发机体产生免疫反应,限制了其在基因治疗领域的临床应用,如何降低rAAV载体的免疫反应已经成为基因治疗领域的研究重点之一。本文从对rAAV载体的选择和对患者免疫抑制调控两个方面介绍降低rAAV载体免疫反应的策略。     

腺相关病毒载体介导的人内皮抑素的体外表达及对内皮细胞抑制作用的研究

抗血管生成基因治疗是一有希望的抑制肿瘤生长及转移的方法.在实验中构建了含有人内皮抑素(endostatin)基因的重组腺相关病毒载体rAAV-hE.所包装纯化的重组病毒滴度达0.5×1012v.g./ml.rAAV-hE能有效感染培养细胞,EIA法检测培养液上清中内皮抑素浓度达36.42ng/ml.rAAV介导所表达的内皮抑素对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)和牛毛细血管内皮细胞(BCE)具有抗增殖抑制作用,抑制率分别为68.1%和41.6%.此结果为进一步的动物实验奠定了基础,表明重组腺相关病毒载体介导的抗血管生成有望应用于肿瘤基因治疗.     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒 (rAAV) 载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统

重组腺伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)载体是目前较理想的基因治疗载体之一,但难以大规模制备一直是影响其广泛应用的主要因素.曾组建了一种表达2型腺伴随病毒(adeno-associated virus type 2,AAV-2) Rep和Cap的重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/DUL2,现在此基础上,证实了该重组病毒支持rAAV的复制与包装,包装出的rAAV具有感染性;构建了携带新霉素抗性基因、适合多种外源基因插入的通用型rAAV载体质粒pSNAV-2及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的rAAV载体质粒pSNAV-2-GFP,建立了稳定携带GFP基因表达盒的rAAV载体细胞株;确定了HSV1-rc/DUL2感染载体细胞株时的最佳感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.1;采用“一种病毒感染一个载体细胞株”的策略,用“感染”的方式代替传统的“转染”方式,使每个细胞产生的rAAV比传统方式提高了2个数量级以上,并实现了rAAV的规模化制备,为rAAV用于基因治疗的临床试验打下了基础.     

2型腺相关病毒载体介导正常人β珠蛋白基因在重型地贫流产胎儿造血细胞中的表达

目的:探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导人β-珠蛋白基因转染地贫患者造血细胞治疗β-地中海贫血的可行性.方法:分离β 41-42/β 654杂合子型重型β-地贫流产胎儿造血细胞,经rAAV2-β-globin病毒转染(MOI=50)后移植入经X射线照射的BALB/c裸小鼠体内,分别于移植后14d、21d处死受体小鼠,RT-PCR及等位基因特异性PCR法检测人珠蛋白基因在受体小鼠体内的表达.结果:RT-PCR方法于3只受体小鼠骨髓样本中成功检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达,而21d处死的转染与对照小鼠外周血样本中未检测到人β-珠蛋白基因表达;等位基因特异性PCR方法在所有受体鼠体内同时检测到β 41-42和β 654突变基因,以及正常β-珠蛋白基因的表达,但rAAV2-β-globin转染组小鼠体内正常人β-珠蛋白基因表达水平明显高于对照组.结论:rAAV2可有效转染β 41-42/β 654杂合子型重型地中海贫血患者造血细胞,并通过exvivo途径介导β-珠蛋白转基因的体内表达,提高红系细胞内正常β-珠蛋白基因的表达水平.