鼠疫耶尔森氏菌LcrV基因的克隆与表达研究

目的研究鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)保护性抗原V蛋白的生物学活性,进而研究Y.pestis的致病机理.方法采用PCR方法,从Y.pestis菌种中扩增出LcrV基因片段,进行鉴定后,然后将该片段克隆于原核表达载体pBV220,构建成重组质粒pBV/LcrV,进行温控诱导表达.结果(1)获得长约980bp的PCR片段,序列分析结果与已知LcrV序列相同.(2)SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量38×103处有表达条带.(3)经薄层扫描分析,目的蛋白条带占全菌蛋白的38.4%.(4)表达后菌体超声破碎后,目的蛋白主要存在于上清中.结论获得了LcrV基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达产物主要以可溶状态存在.     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属中致病性细菌有3种，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。其中鼠疫耶尔森氏菌是致病性最强的一种。随着分子生物学的研究进展，人们对鼠疫菌有了深入的了解。鼠疫菌外膜蛋白（Yops）是近些年对鼠疫菌的基础研究内容焦点之一。国内在世界上首先发现鼠疫菌锡林郭勒高原型病原体缺少32Kd外膜蛋白和40Kd蛋白位于膜内，     

类Orientalis鼠疫耶尔森氏菌的基因分型及鼠疫大流行

在过去的1500年中，共发生过三次鼠疫大流行，鼠疫耶尔森氏菌引起了其中的第三次大流行。鼠疫耶尔森氏菌的DNA也在第二次大流行中人类的遗骸中发现。鼠疫耶尔森氏菌的Antiqua生物型可能引起了第一次大流行，其他的2种生物型，即Medievalis和Orientalis可能分别引起第二次和第三次大流行。为了验证这种假说，我们设计了一种称作“多间隔区(指基因组内已知基因间的DNA序列)分型法”的原始基因分型系统，该系统的原理是测量基因间间隔区的DNA序列。当多间隔区分型法用于分析可能死于第一次及     

中国鼠疫耶尔森菌染色体结构特征的研究

目的 了解中国鼠疫耶尔森菌不同分离株之间的染色体结构差异,探索染色体重排在鼠疫菌中发生的原因及用于菌株遗传特征识别和亲缘关系分析的可能性.方法 以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92(美国)为参考株,以从中国分离出的已完成全基因组测序的4株鼠疫菌株(内蒙古91001、云南剑川D182038、云南玉龙D106004、西藏那曲Z176003)为对比株,根据美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上公布的这5株鼠疫菌的染色体序列及染色体上所有编码基因序列间的相似性,将鼠疫菌染色体人为的划分成多个大的DNA节段(染色体板块),确定这些板块在不同鼠疫菌株间排列方式的差异以及板块之间的断裂区片段的基因组成;根据菌株两两比较所得的重排差异结果,分析菌株间的亲缘关系.结果 除Z176003菌株外,CO92、D182038、D106004、91001菌株可被分成44个相对独立的染色体板块,板块内部基因组成和排列高度稳定,板块之间可以相对移动.与参考株CO92菌株比较,D182038、D106004菌株染色体均存在13处重排,Z176003菌株染色体存在14处重排,91001菌株染色体存在37处板块排列顺序的改变.菌株间两两比较,D106004与Z176003菌株之间仅有8处染色体板块排列方式不同,表明二者的亲缘关系最为接近.CO92菌株染色体上的相邻板块之间存在43个断裂区,有39个断裂区的DNA片段含有插入序列,其中25个插入序列为IS100.结论 鼠疫菌基因组具有一定的流动性,不同菌株间的染色体结构存在较大差异,染色体重排事件发生的原因与其拥有的插入序列密切相关.菌株间染色体的重排差异,能用于菌株遗传特征的识别和亲缘远近关系的分析.     

鼠疫耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳分析

目的 对鼠疫菌的全DNA进行酶切，了解我国各别生态型的鼠疫耶尔森氏菌在核酸水平上的差异。方法 用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法进行分析。结果 用PFGE可将20株鼠疫菌分成5个核型，I型为布氏田鼠型和青海田鼠型菌；Ⅱ型为滇闽居民区型菌和滇西丛谷型菌；Ⅲ型为祁连山型、青藏高原型和1株分离自四川患的鼠疫菌。西藏仲巴地区的2株菌各为一个型。结论 提示脉冲场凝胶电泳分析可用于鼠疫耶尔森氏菌遗传关系的研究。     

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的　了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法　 PCR反应及 Southern杂交分析。结果　对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论　鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;该方法有助于鼠疫耶尔森氏菌与其它菌株的鉴别诊断     

鼠疫耶尔森氏菌快速检测研究进展

目的论述一套对鼠疫耶尔森氏菌特异性强、快速、灵敏度高的快速检测方法,对鼠疫做到早发现、早预防、早诊断、早治疗,预防和控制鼠疫的发生和流行。方法查阅和收集国内外相关鼠疫耶尔森氏菌快速检测的文献和资料。结果鼠疫耶尔森氏菌检测技术向着快速、敏感、特异的标准化和国际化方向发展,其检测技术更加先进、齐全、完备。结论鼠疫耶尔森氏菌的检测技术从细菌学、血清学及分子生物学等正向更快速、更先进的方向发展,这对鼠疫防治将发挥重要作用。     

鼠疫耶尔森氏菌16S-23SrRNA基因间区分析

目的　发展一种快速准确的鉴定鼠疫菌的方法。方法　 Ｐ Ｃ Ｒ 反应加限制性内切酶消化的方法。结果　对来自不同疫源地的 １０３ 株鼠疫菌 １６ Ｓ２３ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因间区进行扩增,均可扩出两条长为 １ １４６ｂｐ 及 １ ０９０ｂｐ 的片段,扩增产物用限制性内切酶 Ｔａｑ Ｉ, Ｍ ｓｐ Ｉ消化后的酶切图谱相同。而对照菌株小肠结肠炎耶尔森氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,大肠杆菌,痢疾杆菌,霍乱弧菌的扩增产物及酶切图谱与鼠疫菌均不相同。结论　鼠疫菌 １６ Ｓ２３ Ｓｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因间区高度同源,基本为两种类型,长度分别为 １ １４６ｂｐ 及 １ ０９０ｂｐ,其他菌株与其明显不同;该方法将有助于快速准确的鉴定鼠疫菌。     

鼠疫耶尔森氏菌质粒提取方法的改进

大多数鼠疫耶尔林菌均含有三种质粒，分子量分别为６５，４５和６Ｍｄａｌ。其中两种属大质粒，分离提取较困难。本实验在参照Ｃａｓｓｅ法基础上对质粒提取中诸多影响因素逐一进行测试比较，选择出质粒提以的最适条件：细菌培养于２８℃，１８－２２小时，菌液浓度为２００ｍｇ／ｍｌ，溶菌液ＳＤＳ终浓度２％，每１０ｍｌ溶菌液加０．１ＮＮａＯＨ１．３５ｍｌ，４５℃温育３０－４０分钟。建立了一种简便，快速且重复性较高的提取     

鼠疫菌特异基因的克隆表达和抗原性分析

目的 在大肠埃希菌中克隆表达鼠疫菌特异基因(YPO1089.pst、ymt),分析重组蛋白的抗原性.方法 利用PCR技术扩增目的 基因,PCR产物经纯化、双酶切后,与质粒载体pET-30a(+)相连接并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞.经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达目标蛋白,并进行10%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白免疫印迹分析其特异性,最后采用亲和层析法纯化诱导表达的融合蛋白.结果 成功构建了pET-YPO1089、pET-pst和pET-ymt 3个重组表达质粒,经优化诱导表达条件,重组的rYP01089、rPst和rYmt在大肠埃希菌中均得到了稳定高效地表达;免疫印迹结果表明重组的rPst可与鼠疫阳性血清发生特异性的免疫反应;目标蛋白经纯化后纯度可达95%以上.结论 鼠疫菌的特异性抗原能够在原核蛋白表达系统中获得高效表达,rPst具有敏感且特异的免疫学特性,实验结果为开发新型鼠疫诊断试剂奠定了基础.     

鼠疫菌6MD质粒在假结核菌中的表达及其对假结核菌毒力的影响

使用电穿孔转化技术,将鼠疫耶尔森氏菌所携带的6MD 质粒转移到假结核耶尔森氏菌中,获得了杂交菌株。该杂交菌株能够表达鼠疫菌素Ⅰ及凝固酶,但其毒力却仍与作为受体的假结核菌株类似,而没有向鼠疫菌的毒力水平接近。本文对这种现象的可能原因进行了分析。     

鼠疫菌fra基因探针的研究

利用ＰＣＲ的方法，由鼠疫菌的ＤＮＡ中扩增获得了单一的，长２４９ｂｐ的基因片段。这一反应的特异性良好，可以作为鼠疫菌的一种鉴定标志。将这一片段地高辛标记制成探针，与国外已经试用过的，来自９．５ｋｂ质粒的９００ｂｐ探针相比较，表明该探针的特异性优良，可用于鼠疫的监测与对鼠疫菌分子生物学的进一步研究。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

贵州省鼠疫耶尔森菌生物学特征研究

目的研究贵州省鼠疫耶尔森菌的生物学特征,探讨疫源地性质。方法对37株鼠疫菌进行生化试验、营养需求试验、毒力基因检测、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场电泳分析。结果37株鼠疫菌均不发酵鼠李糖和甘油,发酵麦芽糖和阿拉伯糖,脱氮阳性。选择20株代表菌株检测均为苯丙氨酸依赖(Phe )、谷氨酸半依赖(Glu±);用Pla、Cafl、inv、hms4对引物分别进行PCR扩增,均得到456、249、1000和700bp的目标基因条带;随机引物(RAPD)分析均获得505、790、1140和1680bp的条带;脉冲场电泳图谱显示338、242.5、168和77kbp的条带。结论贵州省鼠疫菌株的生物学特征与云南省滇闽居民生态型鼠疫菌相同。     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。     

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

几种鼠疫菌培养基的筛选试验

比较了鼠疫菌在胰酶消化液琼脂培养基、市售普通营养琼脂培养基和以胰蛋白Ｓｉ为主要万分自制的５种培养基上的生长情况。结果显示,鼠疫菌在上述７种培养基上均生长良好,可培养出具有鼠疫菌特点的典型菌落,其中营养琼脂培养基和胰蛋白Ｓｉ（２、３号）培养基操作简便、经济,便于基层使用和实验条件的质量控制。     

对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定

目的对1株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）。方 法用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征。结果该菌 株具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖（＋）、鼠李糖（－） 、麦芽糖（＋）、蜜二糖（－）、甘油（＋）、脱氮（+）,与典型鼠疫菌一致。毒力因子检查结果为均 为阴性;对实验动物小白鼠完全无致死能力。全基因组芯片杂交实验和PCR扩增表明55023菌株没有鼠疫菌 的三个质粒;也不具鼠疫标识基因;pgm位点代表性基因YPO1954扩增阳性,YPO1908扩增阴性,表明其pgm 位点不完整;差异片段（DFR）分型结果表明该菌株缺失了14个DFR,不符合鼠疫菌的特征;多位点序列分 型（MLST）分析结果表明该菌株与鼠疫存在16个碱基的差异,而与血清III型假结核耶尔森氏菌仅相差两 个碱基。结论尽管55023菌株具备鼠疫菌的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌,而可能是血 清III型的假结核耶尔森氏菌;噬菌体裂解结果等表型不能作为鼠疫菌鉴定的最终标准。