利用噬菌体随机肽库技术分析丙肝患者血清中抗HCV抗体的表位

目的：分析患者血清中抗HCV抗体的抗原表位。方法：用Protein A亲和层析柱从患者血清中纯化、制备抗HCV多克隆抗体；以此对噬菌体表面展示的随机6肽库进行亲和筛选。结果：经具有良好富集效果的三轮筛选好，从第三轮挑选出的12个克隆进行结合试验，发现8个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应；测序表明阳性克隆的外源肽具有一定的相似性。用阳性噬菌体克隆检测20例患者血清，有程度不等的阳性反应。结论：用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法 应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

MUC1抗原的表位预测及模拟位的筛选

目的预测MUC1抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟位.方法联合运用多种方法对MUC1的二级结构和表面特性,如理化性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等方面进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果MUC1存在有多个潜在的抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:1-10,24-54,65-77,84-91,108-134,140-156,159-174,179-196,199-210,220-233,237-265,270-299,316-337,351-362,369-396,411-420,445-502.经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP 4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论应用多参数预测MUC1抗原的B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能、选择表达新型MUC1分子奠定了基础.所得序列TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位.     

基于抗原表位预测的MUC1模拟肽表位筛选

目的:预测粘蛋白1(Mucin1,MUC1)抗原的B细胞表位,从噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位.方法:对MUC1的二级结构及免疫原性进行分析,预测MUC1的抗原表位.利用纯化获得的Ma695抗体筛选噬菌体随机12肽库,夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列,竞争性抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆.结果:MUC1存在有17个潜在的抗原表位区域.经3轮筛选,获得了14个阳性克隆,DNA序列分析并推导出其氨基酸序列:KHYDPFHHRMPQ,QADTARS VALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIHYWNHNRV;4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上.结论:预测MUC1抗原B细胞表位,为进一步研究MUC1结构和功能奠定了基础.所得序列KHYDPFHHRMPQ,QADTARSVALAG,VPSKPDLHVRSI及MTPIH YWN HNRV能模拟MUC1抗原表位.     

华支睾吸虫模拟抗原表位的筛选和鉴定

目的从噬菌体12肽库中筛选华支睾吸虫模拟抗原表位。方法应用噬菌体随机12肽库亲和筛选华支睾吸虫病患者混合血清IgG,经过3轮的淘筛,随机挑取蓝色噬菌斑进行扩增,以ELISA检测其免疫活性,挑选免疫活性较高的克隆进行序列分析及免疫学鉴定。结果8个阳性克隆测得6个DNA序列,Western-bloting显示6个单克隆噬菌体均可与华支睾吸虫患者血清反应,斑点免疫金银染色法有3个克隆可被华支睾吸虫患者血清识别。结论应用噬菌体肽库筛选技术可以获得华支睾吸虫模拟抗原表位。     

噬菌体随机肽库筛选MUC1抗原模拟表位

目的噬菌体随机多肽文库筛选及鉴定MUC1抗原的模拟表位。方法利用纯化获得的BC2抗体筛选噬菌体随机7肽库,通过夹心ELISA分析噬菌体克隆,测定阳性克隆DNA序列并进行同源性及氨基酸分析,竞争性抑制实验鉴定噬菌体克隆。结果经3轮筛选,获得了30个阳性克隆,DNA序列分析并推导出氨基酸序列:TAPDLRP、SAPDLRP、AAPDSRP及LAPDFRP。鉴定结果表明:4个噬菌体展示肽克隆抑制率均在50%以上。结论所得序列TAPDLRP、SAPDLRPAAPDSRP及LAPDFRP模拟MUC1抗原表位。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD模拟抗原表位的筛选及分析

目的:用抗-HSV-2gD单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机12肽库中筛选HSV-2gD抗原模拟表位序列.方法:利用HSV-2gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库,经四轮富集筛选,随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA进行序列测定,并利用生物信息学软件对包膜糖蛋白D(gD)进行B细胞抗原表位分析.结果:经四轮生物淘筛后,特异性噬菌体克隆得到了富集.经过对阳性克隆携带的随机12肽序列进行综合生物信息学分析,得到了PYH-H和P-PLW两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序.结论:用噬菌体随机12肽库成功筛选到了两个模拟HSV-2gD抗原表位的主要氨基酸基序,可模拟McAb针对的抗原表位,可能是HSV的替代抗原.该研究方法为研制更有效及更广谱的HSV基因疫苗提供了依据.     

用抗HCV多抗从随机12肽库中筛选抗原表位

目的：用丙型肝炎患者血清中抗丙型肝炎病毒（HCV）抗体从噬菌体随机12肽库中筛选HCV抗原表位。方法：将丙型肝炎患者血清混合,提取纯化的IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆用ELISA法检测其特异性,对4个克隆进行测序。并用ELISA法检测噬菌体克隆的诊断价值。结果：3轮筛选的投入产出比逐轮升高,回收率从(4.6×10-4)%增加到(5.3×10-2)%,具有良好的富集效果。对从第3轮洗脱物中挑选出的18个克隆进行结合试验,发现所挑的克隆与丙型肝炎患者的多克隆抗体有较强的结合力。其中4个克隆测序显示为同一克隆（命名为C1）,其外源插入肽为GSMSPYVRWYTP。用C1检测20例丙型肝炎患者血清的检出率为85.0%。结论：成功地用噬菌体12肽库对丙型肝炎患者血清进行了模拟肽筛选,且得到的模拟肽分子C1具有一定的诊断价值。     

日本血吸虫尾蚴抗原模拟表位的筛选及其免疫保护性

目的 筛选日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，探讨其对日本血吸虫的免疫保护性。方法 用粗提日本血吸虫尾蚴抗原的抗体IgC作配体筛选噬菌体12肽库，按“吸附－洗脱－扩增”的过程进行三轮筛选；随机挑取单个噬菌体克隆进行Dot-ELISA检测；用混和噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染45d后剖杀冲虫，计算虫数及肝卵数。结果 经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，挑取11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定，均与日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清呈特异性反应。与对照组相比，混和噬体克隆免疫小鼠的减虫率为18.79%，减卵率为38.00%。结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫尾蚴抗原的模拟表位，这些表位能诱导对日本血吸虫的保护性免疫。     

旋毛虫抗原模拟表位抗原的筛选及序列分析

目的 分析旋毛虫抗原模拟表位的抗原性及其序列。方法 利用旋毛虫病患者血清免疫球蛋白(Ts-Ig)筛选噬菌体12肽库,以旋毛虫幼虫抗原(TsA)为对照,通过ELISA鉴定筛选所获抗原模拟表位(T1-T6)的抗原性,同时检测这些模拟抗原的DNA序列并分析其氨基酸组成。结果 T1-T6灵敏性及特异性与TsA无明显差异(P>0.05),其中T3,T6与肺吸虫病患者血清无交叉反应,特异性高于TsA(P<0.05),T6与日本血吸虫病患者血清无交叉反应,特异性亦高于TsA(P<0.05)。T1-T6编码的氨基酸序列有同源性,其末端三个氨基酸残基均相同,依次为:苯丙氨酸(F),天冬酰胺(N),脯氨酸(P)。结论 筛选噬菌体12肽库获得的旋毛虫抗原模拟表位具有较好的抗原性,有望发展成为新型旋毛虫病诊断抗原,而F,N,P三个氨基酸残基可能与其较好的抗原性有关。     

TNF结合肽和TNFR封闭肽的筛选及其鉴定

目的筛选能与TNF—α结合的环肽（称为TNF结合肽）以及既能与TNFR—1结合又不诱导TNFR相关生物学效应的环肽（称为TNFR封闭肽）。方法采用噬菌体随机肽库展示技术分别以hrTNF—α和hrTNFRI为诱饵进行亲和筛选，ELISA方法进行噬菌体特异性鉴定，应用细胞毒抑制实验和RT—PCR技术等进行噬菌体的生物学效应鉴定。根据噬菌体展示肽的DNA序列合成环肽。结果对肽库进行3轮筛选后，噬菌体克隆具有良好的富集效果；5种TNF结合噬菌体克隆（5、6、7、32及38号克隆）和2种TNFR封闭噬菌体（X2、X4号克隆）分别能与TNF-α和TNFR特异性结合，并且均能显著抑制sTNF—α对L929细胞和U937细胞的杀伤作用，TNFR封闭噬菌体不仅本身无促进U937细胞IL-1β mRNA转录的作用，而且还能有效抑制sTNF—α的生物学效应；并且发现x4与32号、x4与38号联用的细胞毒抑制效应均较其单独作用的效果好，其中X4与38号联用的抑制率高达85．3％，显著高于各自单独的抑制作用（P〈0．01）。选择32、38和x4号噬菌体克隆进行DNA测序并合成环肽。结论从噬菌体随机环肽库中筛选得到能够抑制sTNF-α生物学功能的TNF结合肽和TNFR封闭肽，为研制TNF相关的多肽类抗炎药物奠定了实验基础。     

应用噬菌体7肽库筛选泡球蚴Em18抗原模拟表位的初步研究

目的：从噬菌体7肽库中筛选泡球蚴Em18抗原模拟表位,为研究和开发新的包虫病诊断抗原提供实验依据.方法：用纯化后的rEm18-GST免疫新西兰白兔,获得抗rEm18-GST的多克隆抗体,进一步纯化,获得抗Em18多克隆抗体IgG,以之作为靶分子,免疫筛选噬菌体随机7肽库.经过5轮的淘筛过程,随机挑取9个蓝色噬菌斑扩增,核苷酸序列测定分析并与Em18进行同源性比较.结果：经5轮筛选后,阳性克隆得到富集,9个噬菌体克隆的氨基酸序列与Em18无同源性.结论：所得肽段可能是Em18抗原模拟表位.     

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。     

抗IgE中和抗体表位的筛选和鉴定

目的: 对噬菌体线性7肽库进行筛选,得到诱发机体产生抗IgE中和抗体的IgE表位肽. 方法: 以抗IgE抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA鉴定阳性克隆. 结果: ELISA鉴定随机挑选的经3轮筛选后所得48个噬菌体克隆,其中15个克隆显示与抗IgE抗体有较强的结合能力,序列测定得到氨基酸序列为:DHIDMGL;DHMWLGL;DHQDAGF;DHMDQNL. 竞争性ELISA结果显示4个序列均能与IgE竞争性结合抗IgE mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽能与抗IgE抗体特异性结合. 结论:经筛选得到的7肽序列具有相似的骨架区,并与IgE的CH3区高度同源. 初步验证这些噬菌体展示肽能与抗IgE中和抗体特异性结合,为IgE相关多肽疫苗的研究提供了依据.     

日本血吸虫成虫67kD抗原模拟表位的筛选及其免疫原性

目的：筛选日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，对其免疫学活性予以鉴定。方法：用粗提日本血吸虫成虫67kD抗原的抗体IgG作配体筛选噬菌体12肽库，随机挑取三轮筛选后的噬菌体克隆，Dot-ELISA检测其特异性：用混和阳性噬菌体克隆免疫小鼠3次，攻击感染后45d剖杀，计数虫荷。结果：经三轮筛选，特异噬菌体得到富集，挑取的11个噬菌体克隆经Dot-ELISA鉴定均与67kD抗原免疫血清呈阳性反应。混合噬菌体克隆的免疫血清可识别67kD抗原，并具有一定的抗血吸虫的免疫保护效果。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了日本血吸虫成虫67kD抗原的模拟表位，这些表位具有良好的免疫原性。     

噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位

目的 利用噬菌体12肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体(EGFR)抗原模拟表位。方法 以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗及尼妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选表皮生长因子受体抗原模拟表位,经过3轮淘选后,选择可与西妥昔单抗及尼妥珠单抗有不同程度结合的噬菌体,对阳性产物进行克隆及测序。结果 发现17个和21个阳性噬菌体分别与西妥昔单抗及尼妥珠单抗不同程度地结合;阳性克隆测序结果分别获得了3种不同的氨基酸序列。结论 初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体展示的随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％     

从噬菌体随机肽库中筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽的研究

目的获得具有生物学活性的SARSN蛋白的模拟肽。方法以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位,即由ELISA鉴定出单克隆抗体C00835个阳性克隆,确定氨基酸序列GXLXTPXXXXGT为SARSN蛋白的一个表位;单克隆抗体C03941个阳性克隆,确定氨基酸序列TTLPXXXXAXXX为SARS病毒N蛋白的另一个表位。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARSN蛋白的2个不同模拟表位,为用SARS表位去探索其病毒的结构及疫苗的研制创造了条件。     

结核分枝杆菌抗原模拟表位肽的筛选及免疫活性鉴定

目的：从噬菌体随机12肽库中筛选结核分枝杆菌模拟抗原表位,并初步研究其免疫活性。方法：以鹿结核阳性血清纯化多克隆抗体IgG作为固相配基筛选噬菌体随机12肽库,按吸附-洗脱-扩增过程进行3轮筛选,随机挑取20个单克隆进行特异性鉴定,将筛选后得到的阳性克隆扩增后免疫BALB/c小鼠作为实验组;以TBS为阴性对照组,BCG为阳性对照组,采用间接ELISA方法检测抗体效价,MTT法检测淋巴细胞增殖能力。每组小鼠免疫3周后再鼻腔接种BCG,3周后无菌取左全肺研磨计算肺脏荷菌量,取右全肺制备病理切片观察肺脏病理变化。结果：经三轮筛选后阳性克隆得到富集,ELISA鉴定20个单克隆中有15个阳性克隆阳性率为75%。免疫后实验组小鼠抗体水平高于BCG组(P<0.01)。小鼠脾淋巴细胞增殖实验,经ConA、LPS、PPD刺激后实验组SI值均高于BCG组,但差异无显著性(P>0.05),与TBS组比较差异有显著性(P<0.01)。实验组、BCG组均观察到少量的淋巴细胞浸润,而TBS组肺泡结构消失,组织发生实变。肺脏荷菌量实验显示实验组肺脏荷菌量［(4.080±0.035)log CFU·mg^-1)］ 低于TBS组［（4.360±0.110)log CFU·mg^-1］　(P<0.01),但高于BCG组荷菌量［(3.980±0.023)log CFU·mg^-1］(P>0.05)。结论：成功筛选得到含有结核分枝杆菌抗原模拟表位的阳性克隆,这些阳性克隆能有效诱导小鼠产生比BCG更高的抗体效价和保护效应,对其进行进一步序列测定和功能分析将有助于结核病疫苗的开发。