siRNA对骨肉瘤U20S细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA(small interfere RNA)技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体(PGCsilencerTM-MDM2 siRNA).实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体(PGCsilencer TM-MDM2 siRNA);PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降(P＜0.05),转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异(P＞0.05).结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

沉默Sema6A基因对骨肉瘤细胞U-2OS增殖和转移的影响

目的检测信号素6A(Sema6A)基因在骨肉瘤细胞系中的表达情况,探讨RNA干扰Sema6A基因对骨肉瘤U-2OS细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨肉瘤细胞株U-2OS、Saos-2及MG-63中Sema6A的mRNA表达水平。设计并合成针对Sema6A的小干扰RNA(siRNA)3条及阴性对照siRNA,在Lipofectamine RNAi MAX介导下转染U-2OS细胞,通过qRT-PCR检测Sema6A mRNA水平表达及蛋白质印迹法检测Sema6A蛋白水平,进而筛选出转染效率高的siRNA,CCK-8检测各组细胞活力,Transwell细胞侵袭和迁移实验检测各组细胞的侵袭及迁移能力。结果骨肉瘤细胞株中,Sema6A mRNA在U-2OS中表达最高。瞬时转染Sema6A siRNA的U-2OS细胞中Sema6A的mRNA及蛋白水平较阴性对照组均下降,与阴性对照组相比,实验组细胞的增殖、侵袭及迁移能力均增强,差异有统计学意义(P0.05)。结论 RNA干扰沉默Sema6A基因可以增强U-2OS细胞的增殖、侵袭及迁移能力。     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

siRNA抑制人卵巢癌SKOV-3细胞MDM2的表达及细胞增殖的研究

目的 研究siRNA对人卵巢癌细胞SKOV-3细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入SKOV-3细胞;转染siRNA MDM2(简称si-MDM2)转染阴性对照质粒到SKOV-3,并设只加转染试剂作空白对照组,采用MTT法检测si-M...     

siRNA前体慢病毒干扰A549细胞株蛋白激酶2a表达的载体构建及鉴定

目的构建针对蛋白激酶2a（caseinkinase2a,CK2a）基因的siRNA前体（shortharpinRNA,shRNA）表达载体,鉴定CK2a基因干扰效率。方法体外设计并合成针对CK2a基因的慢病毒shRNA干扰载体,通过PCR及测序证实载体构建成功。将人肺腺癌细胞株A549分为3组,病毒干扰组（CK组）将慢病毒颗粒以最适滴度感染细胞株A549,病毒空载组（NC组）将慢病毒颗粒空载体感染细胞株A549,阴性对照组（CON组）为未经任何处理的细胞株A549;检测各组CK2a的干扰效率。结果构建的慢病毒载体序列通过PCR、测序等鉴定证实与设计序列相同;实时定量PCR检测显示CK组A549细胞CK2amRNA表达率较NC组及CON组下降约80％;Westernblotting显示CK组A549细胞表达CK2a蛋白量较NC组及CON组明显减少。结论构建的shRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株CK2a基因的表达。     

MDM2在食管鳞癌中的表达和意义

目的：探讨癌基因ＭＤＭ２在食管鳞癌中的表达和意义。方法：采用免疫组织化学链菌素亲生物素蛋白过氧化物酶连接法（ＳＰ法）检测ＭＤＭ２在食管鳞癌中的表达,将检测结果与临床资料进行统计学分析。结果：ＭＤＭ２蛋白阳性率为４１．４％,与食管鳞癌细胞学分级呈负相关（Ｐ〈０．０５）。与食管鳞癌ＴＮＭ分期呈负相关（Ｐ〈０．０５）。结论：ＭＤＭ２蛋白表达可作为 食管鳞癌细胞学分级和ＴＮＭ分期的参考指标之一。可能和预后     

MDM2蛋白在下咽癌中的表达

作者采用免疫组化方法研究下咽癌中MDM2蛋白的表达情况,探讨MDM2蛋白异常表达的特点以及与分级和淋巴结转移的关系。     

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。     

HLA-G基因siRNA真核表达质粒的构建及其对转染JEG-3细胞株HLA-G表达的抑制作用

目的:构建针对人类白细胞抗原-G基因(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因siRNA表达质粒,观察其对转染JEG-3细胞的HLA-G基因表达的抑制作用。方法:选择RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化pSuppressor-U6-neo连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。将重组真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、Western-blot方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平。结果:双酶切鉴定及测序图显示,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。RT-PCR和Western-blot结果均表明瞬时转染重组pSuppressor-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。结论:本试验成功构建了针对HLA-G基因的siRNAs表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,瞬时转染JEG-3细胞后可以明显抑制HLA-G基因的表达。     

Costunolide,an active sesquiterpene lactone,induced apoptosis via ROS-mediated ER stress and JNK pathway in human U2OS cells

Costunolide, an active sesquiterpene lactone, is derived from many herbal medicines and it exhibits a broad spectrum of bioactivities such as anti-inflammatory, potential anti-tumor activity. Herein we assessed the anti-cancer effects of costunolide on U2OS cells and explored the underlying molecular mechanisms. The experiment data show that Costunolide exhibited significant anti-tumor activity by apoptosis related assays including Annexin V-FITC/PI flow cytometric analysis and 4,6-diamino-2-phenyl indole (DAPI) staining morphological analysis. Furthermore, we found Costunolide induced the loss of mitochondrial transmembrane potential, down-regulated Bcl-2/Bax ratio, encouraged Cyt-c release and caspase activation. All those effects are contributed by reactive oxygen species (ROS) generation and ER stress-induced mitochondrial dysfunction which are also responsible for c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation. After the treatment of JNK inhibitor SP600125, it obviously reversed costunolide-induced apoptosis. Given N-acetyl-l-cysteine (NAC) effectively blocked the activation of JNK. Taken together, our results demonstrate that costunolide induces apoptosis in human U2OS cells through ROS generation and p38 MAPK/JNK activation.     

siRNA靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌的凋亡抑制基因bcl-2和环氧合酶-2基因表达的影响

目的应用siRNA靶向沉默人胰腺癌Capan-2细胞的hTERT基因表达,观察其对凋亡抑制基因（bcl-2）和环氧合酶-2（COX-2）基因表达的影响。方法应用脂质体Lipofectamine2000作为基因转染的载体,实时PCR进行扩增检测转染细胞的hTERT、bcl-2、COX-2基因的mRNA表达水平,应用Western blotting检测hTERT、bcl-2、COX-2蛋白表达水平。结果在hTERT-siRNA完全沉默hTERT表达的基础上,bcl-2、COX-2基因mRNA表达的量在hTERT-siRNA转染后48h均明显受到抑制（P〈0.001）,抑制率分别为87.86%、100.00%,但在72h后均恢复至与对照组相似的水平,而阴性对照组、Lipo对照组与空白对照组的各基因表达量差异均无统计学意义（P〉0.05）。bcl-2、COX-2蛋白水平在转染48h和72h后被分别下调了58.54%和63.44%、50.06%和82.77%（P〈0.01）,Lipo对照组和阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 siRNA靶向沉默hTERT基因表达,可在一定程度上抑制人胰腺癌Capan-2细胞的bcl-2、COX-2基因的表达。     

Functionalization of single-walled carbon nanotubes enables efficient intracellular delivery of siRNA targeting MDM2 to inhibit breast cancer cells growth

The delivery of DNA or RNA to cells represents the limiting step in the development of cancer gene therapy and RNA interference protocols. Single walled carbon nanotubes (SWNTs) are of interest as carriers of biologically active molecules because of their ability to cross cell membranes. In this study, we developed a novel strategy for chemical functionalization of SWNTs (f-SWCNTs) with DSPE-PEG-Amine to bind small interfering RNA (siRNA) by disulfide bonds applied to siRNA-mediated gene silencing in breast cancer cells. Results indicated the efficiency of f-SWNTs carrying siRNA reached 83.55%, and the new f-SWNTs-siRNA-MDM2 complexes were successfully introduced into the breast carcinoma B-Cap-37 cells at a concentration of 100 nM in mediums, and caused proliferation inhibition of B-Cap-37 cells significantly. The proliferation inhibition ratio of B-Cap-37 cells was detected as 44.53% for 72 h, and the apoptosis ratio was measured as 30.45%. It was obvious that MDM2 can serve as a novel therapeutic target by an effective carrier system of DSPE-PEG-Amine-functionalized SWNTs, which would be very advanced and significant to therapy of breast cancer further.     

MDM2在食管鳞癌中的表达及其意义

目的探讨MDM2蛋白在食管鳞癌中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法分别对49例食管鳞癌组织、30例癌旁非典型增生组织及49例正常黏膜组织中MDM2蛋白的表达进行检测。结果正常食管黏膜组织MDM2蛋白阳性表达率为30．61％（15／49）,非典型增生组织MDM2蛋白阳性表达率为60．33％（19／30）,食管鳞癌组织中MDM2蛋白阳性表达率为87．76％（43／49）;三者两两相比,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论MDM2蛋白表达与食管鳞癌的发生发展有关。     

MDM2和p53基因蛋白在急性白血病细胞中表达及与化疗反应的关系

目的：研究人急性白血病（ＡＬ）细胞ＭＤＭ２及ｐ５３基因蛋白表达水平、它们的相互关系及对ＡＬ化疗反应预测的价值。方法：免疫组化方法检测ＭＤＭ２及ｐ５３蛋白。结果：①４６例ＡＬ细胞ＭＤＭ２蛋白阳性率为７１．７％，ｐ５３蛋白阳性率为２１．７％，无细胞类型不同的差别（Ｐ＞０．０５），复发难治组比初发未治组约高１倍；②ＭＤＭ２与ｐ５３蛋白呈反向表达者多见，以ＭＤＭ２（＋），ｐ５３（－）方式表达（６７．４％）高于同向方式表达（１５．２％）（Ｐ＜０．０１）；③ＭＤＭ２蛋白阴性者骨髓缓解（ＢＭＲ）率（６９．２％）高于阳性者（３３３％）（Ｐ＜０．０５），两种蛋白不同表达关系对化疗效应有影响；④ＡＬ患者４例中２例化疗后ＭＤＭ２蛋白转阴性，获ＢＭＲ，另２例则反之。结论：人ＡＬ细胞ＭＤＭ２蛋白阳性率高，ｐ５３蛋白阳性率低；在同一ＡＬ细胞中两者多呈反向表达，且不同表达方式对化疗有影响；在ＡＬ细胞中确实存在ＭＤＭ２（＋），ｐ５３（－）表达方式。ＭＤＭ２蛋白，特别是ＭＤＭ２蛋白与ｐ５３蛋白联检可能预测ＡＬ细胞对化疗的敏感性     

高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2的检测及其临床意义

目的研究高分化及去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中MDM2基因和蛋白表达的可行性及临床意义。方法收集17例高分化及去分化脂肪肉瘤,对照组肿瘤标本18倒,均为甲醛固定石蜡包埋组织,MDM2基因检测用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法,以看家基因β-actin为内参照。蛋白检测用免疫组化EnVision二步法。结果用RT-PCR法检测的10例高分化及去分化脂肪肉瘤均有MDM2基因表达,而对照组肿瘤标本只检测到β-actin基因,未检测到MDM2基因。17例高分化及去分化脂肪肉瘤MDM2蛋白表达率显著高于18例对照组肿瘤标本（P〈0.05）。结论在高分化和去分化脂肪肉瘤石蜡包埋组织中,RT-PCR法检测MDM2基因和免疫组化法检测MDM2蛋白可行,且两者结果对其诊断和鉴别诊断有意义。     

C-erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定C—erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体。方法体外合成含针对C—erbB-2特异基因序列的寡核苷酸,并定向克隆入逆转录病毒载体RNAi—Ready pSIREN—RetroQ。结果构建的重组逆转录病毒载体可以被限制性内切酶MIuI、BamHI、EcoRI切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致。结论成功构建了C—erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体pRetroQ／C—erbB-2／siRNA-1、pRetroQ／C—erbB-2／siRNA-2、pSIREN—RetroQ／C—erbB-2／siR—NA-3,为进一步研究p185基因沉默奠定了基础。