应用RNA干扰技术抑制PDE5A3基因在人阴茎海绵体平滑肌细胞表达

目的应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,探讨应用该技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法构建6个靶向人PDE5A3基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5A3基因的表达抑制效果.结果抑制率最高的1、2、4号重组质粒使PDE5A3基因表达在mRNA水平分别抑制(66.26±4.02)%,(54.90±3.06)%,(23.83±3.61)%;在蛋白质水平分别抑制(64.14±3.32)%,(49.21±2.96)%,(29.85±4.91)%.结论RNAi能明显抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,且抑制率具有序列相关性,是潜在的ED基因治疗新方法.     

小檗碱对大鼠阴茎海绵体磷酸二酯酶5mRNA水平的影响

目的 :检测大鼠阴茎海绵体中磷酸二酯酶 5 (PDE5 )mRNA的表达 ,进而探讨小檗碱 (berberine ,Ber)的分子作用机制。　方法 :通过逆转录酶链反应 (RT PCR)技术检测大鼠阴茎海绵体中PDE5mRNA的表达。　结果 :大鼠阴茎海绵体中有PDE5A1和PDE5A2mRNA的表达 ,以PDE5A2为主要的异构酶。与内参照 β 肌动蛋白相比 ,对照组、Ber孵育 1和 3h组的PDE5A1及PDE5A2基因mRNA的相对表达量分别为 :0 .2 2± 0 .0 2 ,0 .4 1± 0 .0 1 ;0 .1 5± 0 .0 1 ,0 .34± 0 .0 2 ;0 .1 0± 0 .0 1 ,0 .1 2± 0 .0 1。与对照组相比 ,PDE5A1、PDE5A2的mRNA表达 ,在Ber孵育 1h组降低了 32 %和 1 7%,3h组降低了 5 5 %和 71 %,其中尤以应用Ber 3h后PDE5A2的mRNA减少最为明显 (n =5 ,P <0 .0 1 )。　结论 :Ber对NO cGMP信号通路的下游关键酶 (PDE5 )具有一定的调控作用 ,尤其是抑制PDE5A2的mRNA表达 ,为Ber治疗勃起功能障碍的分子机制之一。     

低氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡的影响

目的:探讨低氧和SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)凋亡的关系。方法:体外培养CCSMC,免疫组化鉴定细胞;低氧(1%O2浓度)干预12、24、48、72 h,常规氧浓度作为对照,流式细胞术测定细胞周期变化和凋亡情况。结果:体外培养的CCSMC生长良好,抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化DAB法染色阳性。流式细胞术检测CCSMC G0/G1期在48 h内细胞比例逐渐增加,后下降;S期细胞比例与G0/G1期呈相反趋势;G2/M期细胞比例无明显规律。结论:CCSMC在低氧环境下,随时间的延长凋亡程度加重,48 h达到最大值,进一步延长时间细胞裂解,不能加重凋亡。     

siRNA对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶表达的抑制作用

目的观察小干扰RNA(siRNA)对人阴茎海绵体平滑肌细胞5型磷酸二酯酶(PDE5)表达的抑制作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据。方法使用美国Ambion公司提供的设计软件设计人PDE5基因的siRNA序列,并合成3对PDE5siRNA和1对阴性对照siR-NA,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞。RT-PCR法半定量检测siRNA对PDE5mRNA表达的抑制作用;Westernblot法检测海绵体平滑肌细胞PDE5蛋白表达水平。结果siRNA1、siRNA2和siRNA3转染后人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5mRNA表达分别下降58.2%、14.9%和11.9%;PDE5蛋白表达量下降约70.5%、19.8%和17.3%;阴性对照siRNA组未引起PDE5mRNA和蛋白表达的变化。结论体外化学合成的PDE5siRNA能特异有效地下调PDE5基因表达,不同序列特异性的siRNA下调PDE5基因表达的能力不同,为ED的基因治疗提供了新思路。     

阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展

阴茎海绵体平滑肌细胞是组成阴茎海绵体的主要功能成分,其表型转化是平滑肌细胞增殖和迁移的关键性起始步骤。因此,探讨平滑肌细胞表型转化的机制及其影响因子在阴茎勃起功能障碍的防治过程中具有重要意义。目前通常将平滑肌细胞分为收缩型(分化型)和合成型(未分化型、增殖型或去分化型)两种类型,并发现L转化生长因子(TGF-β)、转录因子E2F1、基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)、胰岛素等因素可能影响平滑肌细胞表型转化。本文就近年来阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化及其影响因子的研究进展作一简要综述。     

反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5的抑制作用

目的　观察反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞 5型磷酸二酯酶 (PDE5 )的抑制作用 ,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。　方法　将PDE5基因反义寡脱氧核苷酸与DOTAP转染人阴茎海绵体平滑肌原代细胞 ,Western印迹法检测转染后不同时间 (1～ 4 8h)海绵体平滑肌细胞内PDE5的浓度变化 ,观察反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞内PDE5的作用。　结果　转染后 1～ 6h ,反义组人阴茎海绵体平滑肌原代细胞内PDE5表达量较对照组显著降低 (P=0 .0 0 0～ 0 .0 14 ) ;转染后 12～ 4 8h ,三组细胞内PDE5的表达比较 ,差别无显著性意义 (P =0 .189～0 .96 2 )。　结论　PDE5基因反义寡脱氧核苷酸对人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5有抑制作用。     

家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法对比研究

目的　探索更好、更方便的家兔阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养方法。方法　分别采用组织块法、酶消化法、组织块 酶消化法对家兔阴茎海绵体平滑肌细胞进行培养 ,在倒置显微镜下对培养过程的细胞分别作了生长情况及形态学观察。用HE染色、MTT法分别描绘原代培养细胞的生长曲线、细胞分裂指数曲线 ;用倒置显微镜观察活细胞的贴壁过程 ,计数法测定细胞贴壁率。结果　组织块法及酶消化法培养的细胞其生长状况和形态学各有自己的特点。组织块法的细胞生长慢 ,培养时间相对较长 ,纯度相对较高 ,原代培养细胞生长速度快 ,但由于该法消化时间不易掌握 ,常影响其成功率 ,多数细胞呈梭形 ,细胞的密度高 ,原代培养时间为 7～ 10d。结论　每种培养方法都有各自的优缺点。我们可根据实验的需要而选择不同的方法或联合培养     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的快速分离及鉴定

目的探讨兔阴茎海绵体平滑肌细胞快速分离方法,为应用膜片钳技术研究阴茎勃起机制提供实验材料.方法采用木瓜蛋白酶和胶原酶两步酶解消化法,快速分离出新西兰大白兔阴茎海绵体平滑肌细胞并应用免疫组化鉴定.结果分离的细胞成活率较高,贴壁呈长梭形,胞膜光滑完整,胞浆均匀,可用于膜片钳记录.免疫组化鉴定为兔阴茎海绵体平滑肌细胞.结论酶解消化快速分离兔阴茎海綿体平滑肌细胞为全细胞膜片钳技术研究阴茎勃起功能障碍的电生理机制提供了较好的实验材料.     

阴茎海绵体平滑肌钙信号通路研究进展

早在100多年前，研究者已经注意到Ca^2＋在生命中的作用，但直到1967年，美籍华人张槐耀发现钙调素后，人们才开始对Ca^2＋的作用机理有了深刻的认识，提出了Ca^2＋是胞内的一种第二信使。随着研究的深入，人们发现钙信号通路在生命活动中无处不在，具有非常重要的地位。阴茎勃起与疲软受很多因素的影响，但最终分子机制的共同通路就是钙信号通路。所以研究钙信号通路对阴茎勃起及勃起障碍的生理、病理、诊断及治疗等有很重要的意义。     

阴茎海绵体平滑肌收缩的分子机理研究进展

阴茎勃起或维持疲软状态与否受控于阴茎海绵体平滑肌松弛或收缩的复杂性神经生理过程。尽管已经有些关于阴茎海绵体平滑肌收缩的研究报道,但是其受关注程度远远不如对阴茎海绵体平滑肌松弛机理的研究。阴茎勃起功能障碍即由于在有效性刺激条     

人阴茎海绵体平滑肌细胞三维培养模型的建立

目的 观察人阴茎海绵体平滑肌细胞(hCCMCs)在三维培养系统中的生物学特性.方法 体外分离hCCMCs,并用差速贴壁法进行纯化.免疫组化的方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,进行hCCMCs的鉴定.在单层贴壁培养的基础上,将hCCMCs在胶原凝胶中培养,形成三维培养系统,并对hCCMCs的形态结构、增殖情况进行研究.结果 原代培养的hCCMCs细胞形态不均一,经过差速贴壁法纯化后,细胞形态均一,免疫组化显示大多数细胞α-SMA阳性表达.三维培养系统中,hCCMCs在不同层面上呈三维生长.hCCMCs在三维培养系统中培养10d后,细胞数量无明显增殖(P>O.05),明显低于贴壁培养条件下细胞增殖速率(P<0.01).结论 hCCMCs三维培养系统可以观察hCCMCs在三维条件下的生长、增殖状况,研究hCCMCs与微环境的相互作用关系,有望为相关研究找到一种更为简单、可控性更强的体内实验替代方法.     

Effects of neferine on cytosolic free calcium concentration in corpus cavernosum smooth muscle cells of rabbits

To study the relaxation mechanisms of neferine (Nef) on the corpus cavernosum smooth muscle (CCSM), the CCSM cells from New Zealand White rabbits were cultured in vitro. [Ca(2+)](i) was measured by fluorescence ion digital imaging system (FIDIS), using Fluo-2/AM as a Ca(2+)-sensitive fluorescent indicator. Nef (0.1, 1 and 10 micromol l(-1)) had no effect on the resting [Ca(2+)](i) (P > 0.05). In the presence of extracellular Ca(2+) (2.5 mmol l(-1)), Nef (0.1, 1 and 10 micromol l(-1)) inhibited [Ca(2+)](i) elevation induced by high K(+) and phenylephrine (PE) in a concentration-dependent manner (P < 0.05). In calcium free solution containing egtaic acid (EGTA), Nef (0.1 micromol l(-1)) had no inhibitory effects on [Ca(2+)](i) elevation induced by PE (P > 0.05). However, Nef (1 and 10 micromol l(-1)) inhibited [Ca(2+)](i) elevation induced by PE (P < 0.05). These data suggest that Nef inhibited [Ca(2+)](i) in CCSM cells via blocking voltage-dependent Ca(2+) channel, alpha(1)-adrenoceptor-operated Ca(2+) channel and Ca(2+) release from intracellular Ca(2+) pool. This inhibitory action on [Ca(2+)](i) might be one of the relaxation mechanisms of Nef on the CCSM.     

靶向Pik3cb shRNA表达载体的构建及其对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的构建大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体，并检测其下调大鼠血管平滑肌细胞Pik3cb mRNA表达的效应。方法根据Genbank中大鼠Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-1，酶切鉴定和测序无误后分别命名为pU6-Pik3cb—shRNA．1和pU6-Pik3cb—shRNA-2。通过脂质体转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞，确定转染效率；通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测Pik3cb mRNA的表达；TUNEL法检测细胞凋亡。结果pU6-Pik3cb—shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2经测序和PCR扩增与原序列相同，转染大鼠平滑肌细胞48h时转染率为15．7％，荧光定量PCR结果显示转染组Pik3cb mRNA表达明显减少，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），错配质粒组与对照组比较Pil（3cb mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05）。TUNEL结果显示转染组凋亡细胞明显增加，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建重组真核表达质粒pU6-Pik3cb—shRNA，并有效下调大鼠胸主动脉平滑肌细胞Pik3cb mRNA的表达，为靶向Pik3cb防治移植血管再狭窄的基因治疗奠定了基础。     

大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的构建携载大鼠弹力蛋白原（tropoelastin）基因的重组腺病毒载体，并在体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）中表达。方法利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pShuttleTropoelastin-GFP进行同源重组，筛选出重组黏粒pAdTropoelas-tin-GFP，经过包装、扩增、纯化后获得重组腺病毒AdTropoelasfin-GFP，测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞，一步法提取细胞总RNA，逆转录后，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-timePCR）检测tropoelastin的mRNA。结果得到了携载tropoelastin基因的重组腺病毒，纯化后滴度为5×10^11pfu／ml，腺病毒转染VSMC后1、3dtropoelastinmRNA表达较空病毒明显增高（P〈0．01），并超出空病毒转染组2倍以上。结论成功构建了携带tropoelastin的重组腺病毒载体，体外转染的VSMC有效表达目的基因。     

粉防己碱(Tet)对兔子阴茎海绵体平滑肌细胞质中自由钙离子浓度的影响(英文)

目的:探讨粉防己碱(tetrandrine,Tet)松弛阴茎海绵体平滑肌的作用机制。方法:体外培养新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞,经钙荧光指示剂 Fluo-2/AM 负载后,用荧光离子数字成像系统观察 Tet 对平滑肌细胞内[Ca~(2 )]_i 的影响。结果:Tet(1,10,100μmol/L)对平滑肌细胞内静息[Ca~(2 )]_i无明显影响(P>0.05)。当细胞外钙离子浓度为2.5 mmol/L 时,Tet(1μmol/L,10 μmol/L,100 μmol/L)抑制了高钾和去氧肾上腺素(PE)导致的细胞内[Ca~(2 )]_i 升高(P<0.05),这种抑制作用具有浓度依赖性。在无细胞外钙时,1 μmol/L和10μmol/L Tet 对 PE 引起的细胞内[Ca~(2 )]_i 升高无明显影响(P>0.05);而100 μmol/L Tet 能明显抑制 PE 引起的细胞内[Ca~(2 )]_i 升高(P<0.05)。结论:Tet 通过阻滞电压依赖性钙通道、α_1受体依赖性钙通道和抑制细胞内钙库释放,降低阴茎海绵体平滑肌细胞内[Ca~(2 )]_i 水平,这是 Tet 松弛阴茎海绵体平滑肌的作用机制之一。     

gax基因在移植静脉重塑早期过表达对平滑肌细胞转化态的影响

目的　探讨 gax基因在移植静脉重塑早期过表达对平滑肌细胞 (VSMCs)表型转化的影响。方法　 48只大鼠随机分为实验组与对照组 ,每组 2 4只 ,均行右颈内静脉移植到同侧颈总动脉显微手术。术后 14d取出移植静脉 ,检测并观察 gax基因、凋亡相关基因及VSMCs的表型转化状态。结果　实验组与对照组比较 :gaxmRNA表达明显增加 (10 6.9± 3 8.7,P <0 .0 1) ,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)阳性细胞明显增多 (5 0 .5± 2 0 .4,P <0 .0 1)和增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性细胞显著减少 (3 3 .86± 13 .3 8,P <0 .0 1) ;bcl 2表达明显下降 (13 .0±4.6,P <0 .0 1) ;p5 3、bax表达显著增高 (分别为 2 7.0 0± 7.2 5或 2 8.6± 5 .5 ,P均 <0 .0 1)。结论　gax基因过表达可促进移植静脉合成表型VSMCs的凋亡