聚合酶链反应检测O1群霍乱弧菌肠毒素A亚单位基因

为了加强对霍乱的防治，探索对霍乱弧菌的快速和敏感的检测方法，建立了一种快速标本处理和聚合酶链反应扩增Ｏ１群霍乱弧菌肠毒素Ａ亚单位基因区的诊断方法。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究，探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因，并定向克隆人pNEB193中，然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆人表达载体，SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达，约占细胞总蛋白量的26.7%。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了高效表达H.pylori ureB的重组菌，为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。     

志贺毒素B(ShT-B)亚单位在两种表达载体中表达形式的分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEM -TB3 克隆质粒 ,得到为大小约为 2 2 5bp的ShT -B基因片段 ,分别将其插入到经双酶切的 pQE4 0和 pQE30表达载体中 ,构建了两个ShT -B的重组表达质粒pQE4 0 -B3 和 pQE30 -B2 ,分别转化到E .coliM15。经IPTG诱导后 ,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中 ,pQE4 0 -B3 和pQE30 -B2 ,分别化到E .coliM 15 ,经IPTG诱导后 ,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中 ,pQE4 0 -B3 表达蛋白约占菌体总蛋白的 37% ,主要为包涵体形式。pQE30 -B2 表达蛋白约占菌体总蛋白的 16 % ,主要为可溶性形式 ,约 9 2 %。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

大肠杆菌肠毒素基因多重PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速检测大肠杆菌耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin, STa, STb)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin, LT-Ⅰ, LT-Ⅱ)基因的多重PCR方法。方法 参照文献合成四对可扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)耐热肠毒素基因(estA、estB)和不耐热肠毒素基因(elt-Ⅰ、elt-Ⅱ)的特异性引物,通过反应条件的优化,敏感性、特异性试验和临床样品检测,建立检测大肠杆菌肠毒素的多重PCR方法。结果 用所建立的多重PCR方法可特异性扩增出estA(229 bp)、estB(480 bp)、elt-Ⅰ(605 bp)和elt-Ⅱ(300 bp)基因片段,最低检出量分别为2.55×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL、2×10¹ CFU/μL和2.47×10³ CFU/μL。从22株大肠杆菌分离株中检测到estA基因(2/22),elt-Ⅱ基因(3/22),未检测到estB和elt-Ⅰ基因,检测结果与常规PCR检测结果一致。结论 建立了检测大肠杆菌肠毒素基因(estA、estB、elt-Ⅰ和elt-Ⅱ)的多重PCR方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,能够满足对细菌培养物的检测要求。     

轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达

利用DNA重组技术将轮状病毒（Rotavirus RV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌(Enteotoxigenic Escherichia coli ETEC)热稳定肠毒素（Heat-stable enteotoxin Escherichia coli ST)基因融合，插入原核表达质粒pET-28a( )中，经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4-st片段克隆入PET－28a( ),而且具有正确的读码框和方向性，正确构建了VP4－ST的融合表达载体pET28-VP4-ST。表达质粒转化受体菌BL21（DE3）plysS，取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS－PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明：表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，大小约40．2kDa，表达的蛋白量占菌体总蛋白的13．048％。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因改建及其表达产物粘膜免疫佐剂活性的研究(英文)

目的改建大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因序列以提高重组LTB(rLTB)原核表达量,确定重组改建LTB(rrLTB)粘膜免疫佐剂活性。方法按大肠杆菌偏爱密码子合成全长LTB基因的核苷酸序列。构建pET32a-rLTB原核重组表达质粒及pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3表达系统,提取重组质粒并测定其插入的rLTB基因序列。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶成像分析系统鉴定rrLTB表达产量,并与未改建的重组LTB(roLTB)比较。采用GM1-ELISA确定rrLTB和roLTB结合牛GM1的能力。分别以幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位(rUreB),检测rrLTB和roLTB对rUreB对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠保护作用及产生特异性S-IgA的增强效应。结果pET32a-rLTB-E.coliBL21DE3经1 mmol/LIPTG诱导后,rrLTB表达量约占细菌总蛋白的35.4%,为roLTB(2.8%)的12.6倍。GM1-ELISA结果证实rrLTB和roLTB均能与牛GM1结合。单一rUreB对感染小鼠的免疫保护率为66.7%,但与rrLTB或roLTB合用时,保护率可至91.6%,并可提高感染小鼠特异性S-IgA产生量(P<0.01)。结论改建的LTB基因能明显提高表达量,所表达的rrLTB仍保持较强的粘膜免疫佐剂活性。     

柯萨奇B1病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达柯萨奇B1（CVB1）病毒VP1蛋白。方法：用限制性酶切方法将CVB1 VP1基因从pMD18-T-VP1上切下，连续至pQE30构建原核表达系统pQE30-VP1，经酶切和PCR验证后转化至大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG诱导目的基因表达，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blot检测VP1蛋白的表达，结果：酶切，PCR证明构建的原核表达系统携带方向正确的CVB1 VP1基因。SDS－PAGE和Westernblot;实验均可于33．0kDa处见到目的条带。结论：CVB1 VP1基因在大肠杆菌的成功表达开发新的血清学检测试剂提供了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)无毒突变体mLT63在大肠杆菌中的融合表达及纯化

目的 在大肠杆菌中表达并纯化大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63融合蛋白，并探索其免疫反应性。方法采用不同的诱导温度，IPTG浓度，葡萄糖含量，pH值以及不同的培养基优化重组菌TB1（pMAL-c2X-mlt）的表达条件，表达产物经超声粉碎,超声上清经初步盐析、应用直链淀粉亲和层析柱纯化，Western blot鉴定纯化产物的免疫学反应性。结果 融合蛋白在诱导表达产物中的含量达到16．11％,纯化产物的纯度达到72．58％。纯化产物能够被抗CT血清所识别。结论 成功表达并纯化出了大肠杆菌不耐热肠毒素无毒突变体mLT63，获得了纯度较高并具有良好免疫反应性的融合蛋白。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒性蛋白基因的克隆及其原核表达

目的从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bti）以色列亚种中获得cry4B、cry11A和cyt1A3种主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行克隆和原核表达。方法根据GenBank上3种基因的已知序列设计合成引物,应用PCR技术扩增目的基因,克隆入pUC19质粒,阳性克隆质粒经酶切和测序鉴定。将测序鉴定的3种蛋白基因克隆入原核表达载体（pET32c）进行原核表达。结果PCR扩增获得特异性的基因片段,重组质粒经酶切后获得预计大小的基因片段,并测序鉴定。序列结果与已知序列一致。原核表达载体经ITPG诱导,获得预计大小的目的蛋白。结论成功克隆了苏云金芽孢杆菌以色列亚种的3个主要杀蚊幼虫蛋白的基因,并进行原核表达。     

金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达

目的亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(rSEB)蛋白。方法将含有SEB基因的质粒pMD-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体pGEX-4T-2中构建重组子pGEX-4T-2/SEB,并转化E.coliJM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达rSEB蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组rSEB,West-ern blot鉴定其免疫反应性。结果重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组rSEB蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示rSEB能够被兔抗SEB抗体识别。结论金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组rSEB,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料。     

用含霍乱毒素A2/B的载体在大肠杆菌中表达弓形虫主要表面抗原P30

目的：克隆并表达含有弓形虫P30抗原及霍乱毒素A2／B亚基基因的原核表达载体，为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法：应用PCR方法扩增出P30基因片段后，克隆入含有霍乱毒素A2／B亚基基因的表达质粒pUAB024，在大肠杆菌JM109(DE3)中表达融合蛋白。通过SDS-PAGE电泳及Western blotting进行检测鉴定。结果：电泳证明质粒构建正确，SDS-PAGE显示经IPTG诱导可以产生特异性条带，Western blotting进一步证实该条带为P30-CTA2／B融合蛋白。结论：表达载体pUAB024-P30可有效表达特异性的融合弓形虫抗原蛋白P30-CTA2B。     

大肠杆菌O157VT2 B亚基基因的克隆与表达

目的对大肠杆菌O157VT2毒素B亚基基因进行克隆、表达与鉴定,为VT2毒素的抗原、抗体大规模制备及疾病的预防、诊断和疫苗研究打下基础。方法设计寡核苷酸引物,利用PCR技术从出血性大肠杆菌O157的染色体基因组中扩增出VT2毒素B亚基基因,连接到表达载体pET-28a以构建重组质粒。将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,通过IPTG诱导进行表达,对表达蛋白进行SDSPAGE电泳分析和Western检测。结果用PCR方法扩增出了预期大小的VT2B亚基基因,克隆得到重组质粒pET28aVT2B,转化后宿主菌成功表达分子量为8kD的目的蛋白,用特异抗体经Western检测该条带为阳性反应。结论目的基因成功克隆到宿主菌内,目的蛋白得到高效表达,最佳诱导时间为4h,目的蛋白表达量可达总蛋白量45.72%。     

钩端螺旋体鞭毛蛋白B(FlaB)基因flaB在大肠杆菌内的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达钩端螺旋体内鞭毛蛋白 (FlaB)用于钩体病的诊断和预防。方法　将目的基因flaB定向克隆至原核表达载体 pGEX - 5T ,构建重组融合表达质粒 pGF ;Western -blot鉴定其特异性 ,ELISA法判定其用于钩体病诊断的可行性。结果　GST -FlaB主要以包涵体形式表达 ,表达量约占菌体总蛋白的 4 0 % ;Western -blot结果显示该蛋白与FlaB抗血清能呈现明显的单一条带 ;包涵体经TritonX - 10 0及尿素纯化后 ,纯度可达 90 % ,并且能溶于包被缓冲液中 ;ELISA检测显示纯化后的GST -FlaB具有较好的特异性。结论　钩端螺旋体FlaB可以高效表达并可能用于ELISA检测及钩体病的预防。     

犬钩虫(Ancylostoma caninum)天冬氨酸蛋白酶基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的对犬钩虫(Ancylostomacaninum)天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行了克隆,鉴定,并在原核系统中进行表达。方法以犬钩虫总RNA为模板,用RT-PCR法对犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因进行扩增,获得的AspcDNA产物克隆进pMD-18T载体,用PCR筛选阳性克隆。碱裂解法进行质粒提取,单、双酶切进行鉴定并测序。将测序正确的阳性克隆进行双酶切,构建到表达载体pET-32a中,将此重组质粒先转化到E.coliDH5a内,提取质粒,酶切鉴定阳性,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)菌株内,对转化菌株用IPTG进行诱导培养。收集培养液,破菌、离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达蛋白相对分子量为40kDa,抗体检测有特异条带大小为40kDa。结论成功进行了犬钩虫天冬氨酸蛋白酶Asp基因的克隆表达。     

GST-NP1融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

通过选用大肠杆菌偏好密码子对兔抗御素基因进行改造 ,人工合成兔防御素基因构建大肠杆菌GST -NP1融合基因在大肠杆菌中表达。研究表明 :蛋白质经过亲和层析洗脱纯化 ,SDS -PAGE电泳分析 ,只在目的分子量处出现单一条带。灰度扫描分析表明 ,表达量最高可达总蛋白的 2 7 7%。     

乙型肝炎病毒剪接蛋白在大肠埃希菌中的表达和纯化

目的高效表达并获得高纯度的乙型肝炎病毒剪接蛋白(hepatitis B splicing protein,HBSP)。方法将HBSP编码基因克隆入原核表达载体pET43.1a(+),并在目的基因的C端引入StrepⅡ标签的编码序列,构建HBSP表达载体;将StrepⅡ标签的编码序列置于HBSP基因片段的N端,同时在StrepⅡ和HBSP之间引入终止密码子以构建对照载体。将以上质粒分别转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),以IPTG诱导,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达及其可溶性;通过Strep-Tactin系统亲和层析纯化蛋白,Western blot检测其反应原性。结果成功构建HBSP重组表达载体pET-43-HBSP-StrepⅡ及对照载体pET-43-StrepⅡ,经IPTG诱导后,分别在大肠埃希菌中高表达Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶形式存在于细菌裂解上清液中。通过亲和层析获得纯度超过95%的Nus-HBSP-StrepⅡ及Nus-StrepⅡ融合蛋白,两融合蛋白均能被Strep.TagⅡ单抗识别。结论在大肠埃希菌中可高效、可溶性表达并获得高纯度的HBSP融合蛋白及对照蛋白,为HBSP功能研究打下良好基础。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因的克隆、测序与表达

目的　克隆乙型脑炎病毒E基因并在大肠杆菌中进行表达 ,为今后研制乙脑分子诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。方法　根据乙型脑炎病毒株SA14 - 14 - 2E基因的序列设计一对引物 ,采用RT -PCR技术扩增其E基因全长cD NA ,将扩增产物克隆到pBlusecriptIISK(+)载体中 ,然后亚克隆到原核表达载体PGEX -KG中 ,筛选重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达重组蛋白。结果与结论　获得了含全长乙型脑炎病毒E基因的重组质粒 ,经酶切和测序证实构建正确。表达的目的蛋白经SDS -PAGE和Westernblot分析证实确为乙型脑炎病毒E蛋白且有生物学活性。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的菌株．方法用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上扩增出ＵｒｅＢ基因片段,将其克隆至ｐＳＫ（＋）质粒上,然后插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达．结果经测序ＵｒｅＢ片段有１７０７ｂｐ组成,为编码５６９个氨基酸残基的多肽．ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现,ＵｒｅＢ基因表达的蛋白质分子质量为６５０００Ｕ,并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体．结论重组的ＵｒｅＢ可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗．     

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得pTAT-XIAP融合蛋白;为其用于神经系统疾病的治疗奠定基础。方法体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,转入大肠杆菌表达菌株BL21plysS进行诱导表达。SDS-PAGE及Western blot法鉴定融合蛋白。结果表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,于64 kD处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建了pTAT-XIAP原核表达载体并成功表达出目的融合蛋白,该载体成功表达pTAT-XIAP融合蛋白,有望用于临床神经系统疾病的治疗。