5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

目的探讨体外5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞,传至第3代后,加入5-氮胞苷诱导24h,按照诱导浓度分为对照组、5μmol/L组、10μmol/L组、15μmol/L组4组,培养4w,倒置显微镜观察形态变化,有无自发搏动,在第1、2、3、4w行细胞免疫组化检测α-Actin、Connexin43表达。结果 5-氮胞苷浓度10μmol/L组为适宜诱导浓度,5μmol/L组浓度不能达到诱导分化作用,15μmol/L组细胞死亡率高。未观察到心肌样细胞的单个搏动或多个同步搏动。结论经过5-氮胞苷诱导后的心肌样细胞在形态和结构特性上均与心肌细胞相似,但由于5-氮胞苷为细胞毒性药物,其应用于临床的安全性有待商榷。     

5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

[目的]观察5-氮杂胞苷(5-Aza)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖和成肌分化的影响.[方法]无菌条件下取SD大鼠骨髓组织,采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs,传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后,随机分为4组:浓度为5、10、15μmol/L的5-Aza组和空白对照组,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度5-Aza对MSCs生长增殖的影响;以含5、10、20μmol/L5-Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后,改用完全培养基继续培养,采用免疫组织染色法鉴定5-Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白(myosin)和结蛋白(desmin)的表达情况.[结果]双标免疫组化染色结果显示:所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54,表达率达96%,鉴定结果表明所培养细胞为MSCs;5、10μmol/L5-Aza对MSCs增殖无显著影响(P>0.05),15μmol/L5-Aza可显著抑制MSCs生长(P<0.05);不同浓度5-Aza诱导培养MSCs后第3天,部分细胞出现desmin阳性表达,诱导后14 d,部分细胞表达myosin,以10μmol/L5-Aza组作用为佳.[结论]高浓度5-Aza可抑制MSCs体外增殖;适宜浓度的5-Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化.     

5-氮杂胞苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化过程中PPARγ表达及其作用

目的探讨5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞(MSC)分化过程中PPARγ的表达情况及其在细胞分化过程中的作用.方法利用原代培养小鼠MSC,5-氮杂胞苷诱导分化;脂质体转染法,将pEGFP-N1-PPARγ2表达质粒转入MSC中,G418筛选,RT-PCR检测PPARγmRNA表达,免疫组化检测myosin及PPARγ表达.油红O染色检测细胞内脂滴.结果 MSC在未诱导时不表达PPARγ,经5-氮杂胞苷诱导后,多数细胞向成肌细胞分化,部分细胞表达PPARγ且向成脂肪细胞分化;pEGFP-N1- PPARγ2转染成功的细胞均分化为脂肪细胞.结论 5-氮杂胞苷不仅诱导MSC向成肌细胞分化,也诱导其向成脂肪细胞分化;其诱导MSC向成脂肪细胞分化可能与PPARγ表达有关.     

骨髓间充质干细胞体外培养分化为肌原性细胞的实验研究

目的　研究骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为心肌细胞的可行性。方法　由新西兰大白兔胸骨获取骨髓间充质干细胞 ,培养传代后用 5 -氮杂胞苷诱导 2 4h ,免疫组化检测诱导后细胞的变化。结果　 5 -氮杂胞苷诱导后的细胞经免疫组化检测可见细胞被抗肌红蛋白抗体着染显色。结论　骨髓间充质干细胞可在体外经 5 -氮杂胞苷诱导后转化为肌原性细胞。     

大鼠脂肪组织源性间充质干细胞的分离及向心肌细胞的诱导分化

目的：探讨脂肪组织源性间充质干细胞体外分离培养的方法并将其向心肌细胞方向诱导分化。方法：无菌条件下获取2月龄SD大鼠腹部肠系膜脂肪组织，0．08％胰酶消化分离出单个核细胞，接种7～10d后形成单层贴壁长梭形细胞。0．25％胰酶消化传代，第3代细胞用于鉴定细胞表面分子及诱导分化。浓度为10μmol／L5-氮胞苷与分离细胞共同培养24h，3周后应用抗desmin及抗α-actnin抗体对诱导细胞进行免疫化学鉴定。结果：所分离细胞约90％表达间充质干细胞表面抗原CD13、CD44。5-氮胞苷诱导后3周，所培养的细胞形成desmin及α-actnin染色阳性的心肌细胞团。结论：体外通过消化法可从脂肪组织中分离出大量间充质干细胞，这些细胞经5-氮胞苷诱导后分化为心肌细胞。     

骨髓间充质干细胞向肌管状结构分化的动态

 【目的】探讨5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌细胞分化的最佳条件和体外分化的过程。【方法】体外培养Sprague-Dawley（SD）大鼠的MSCs，传代至P3、P6或P12；用5-氮胞苷诱导，比较不同诱导浓度组、不同诱导时间组和不同体重动物组MSCs的分化率，观察诱导后细胞分化过程中形态学的变化，并且用cardiactroponinⅠ、desmin和α-sarcomeric actin抗体鉴定分化的心肌样细胞。【结果】P12代较P3或P6代骨髓MSCs易向心肌样细胞分化并融合成肌管样结构。经10μmol／L的5-氮胞苷诱导24h后细胞分化率为（27±2．5）％，20μmol／L的5-氮胞苷诱导24h后细胞分化率为（17±2．2）%，其它诱导浓度和诱导时间均不能诱导细胞分化；50g（幼年鼠）体重组细胞分化率为（27±2．8）％，150g（成年鼠）体重组细胞分化率为（15±2．9）％，各组的差异有统计学意义。【结论】5-氮胞苷诱导MSCs向心肌样细胞分化并融合成肌管样结构，年幼的SD大鼠MSCs易向心肌样细胞分化。     

骨髓间质干细胞体外转化为心肌细胞的实验研究

目的　研究鼠骨髓间质干细胞经诱导在体外定向心肌样分化的情况 ,为心衰的干细胞移植治疗提供基础 .方法　取鼠胫骨骨髓 ,分离并培养骨髓间质干细胞 ,用 5 -氮杂胞苷(10 μmol· L- 1 )定向诱导 ,分别在培养的第 7,14 ,2 1,2 8d,用免疫组织化学的方法检测细胞中的纹状肌球蛋白重链 ,并用 RT- PCR对纹状肌肌球蛋白在细胞中的表达进行鉴定 ,取未经 5 -氮杂胞苷诱导正常培养的细胞为对照组 .结果　鼠骨髓间质干细胞经 5 -氮杂胞苷诱导 ,在其培养第 2 1,2 8d,免疫组化检测细胞中的肌球蛋白重链呈阳性 ,RT- PCR方法显示能表达纹状肌球蛋白 ;而培养的第 7,14 d以及对照组 ,免疫组化检测细胞中的肌球蛋白重链呈阴性 ,RT- PCR方法显示不能表达纹状肌球蛋白 .结论　骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞 ,在 5 -氮杂胞苷的定向诱导下 ,可以向心肌样分化 ,有望成为心衰干细胞移植治疗的理想细胞材料 .     

甲基化抑制剂5-氮杂胞苷对HL-60细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系HL-60的增殖抑制作用,探讨其对细胞周期、细胞凋亡的影响.方法:常规方法培养HL-60细胞,加入不同浓度的5-氮杂胞苷,以MTT法测定对HL-60的抑制作用,计算细胞生长抑制率;流式细胞术检测小剂量5-氮杂胞苷处理HL-60细胞后48 h的细胞凋亡率及细胞周期分布特点.结果:不同浓度5-氮杂胞苷均可以不同程度的抑制细胞生长,且表现为时间、浓度依赖性.在小剂量浓度5-氮杂胞苷处理HL-60细胞48 h后,随着5-氮杂胞苷浓度的增加,凋亡细胞百分比逐渐增多(P<0.05);G1期细胞逐渐增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞阻滞在G1期.结论:5-氮杂胞苷对髓系白细胞细胞系HL-60的生长抑制表现为浓度和时间依赖性,一定剂量的5-氮杂胞苷诱导细胞凋亡,使细胞阻滞在G1期.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的探讨用5-氮胞苷(5-aza)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的最佳条件.方法用Percoll密度梯度离心法分离培养、纯化大鼠MSCs,取第3代MSCs随机分为A、B、C 3组,分别加入5、10、20 μmol/L5-aza;每组分别孵育12、24、48 h,继续培养28 d.相差显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测细胞肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达,并通过Western印迹法对细胞cTnT进行定量分析.结果MSCs经5-aza诱导培养28 d后,电镜下见细胞胞浆有散在肌丝样结构,免疫组化检测α-actin和cTnT表达均呈阳性;5 μmol/L的5-aza孵育48 h、10 μmoL/L孵育24 h培养28 d的细胞cTnT表达量与10 μmol/L的5-aza孵育48 h、20 μmol/L 3种孵育时间各组比较无显著性差异,且细胞生物学特性未受到明显影响.结论MSCs在体外经5-aza诱导后可分化为心肌样细胞;5 μmol/L的5-aza孵育48 h和10 μmol/L的5-aza诱导24 h是MSCs体外诱导分化心肌样细胞的理想条件.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离及5-氮胞苷对其的诱导分化作用

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（SD—MSCs）体外分离的方法条件、生物学特性及5-氮胞苷对其的诱导分化作用。方法采用全骨髓贴壁法分离培养SD—MSCs,进行形态学观察,绘制生长曲线,流式细胞仪对其细胞周期进行分析,并通过成脂肪诱导鉴定,给予5-氮胞苷进行诱导分化,通过免疫组化和蛋白免疫印迹法．观察其对超极化激活环核苷酸门控的通道蛋白（HCN2）表达情况。结果SD—MSCs以长梭形和多角形为主,呈放射状集落生长,细胞生长曲线呈S形,增殖能力比较活跃。成脂肪诱导后,细胞胞质内有大量橙红色脂滴形成。不同浓度的5-氮胞苷对SD—MSCs进行诱导分化后,7．5、10、12．5umol／L5-氮胞苷诱导的HCN。表达阳性强度较高,其中101umol／L的5-氮胞苷诱导24h的SD—MSCsHCN。表达强度最高。结论全骨髓贴壁法能够有效分离纯化增殖SD—MSCs,5-氮胞苷能够诱导其分化为HCN2表达阳性的细胞。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

Periodontal ligament stem cells improve peripheral blood mononuclear cells differentiation into osteoclast-like cells

目的 研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制.方法 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞.建立直接共培养和Transwell间接共培养体系.实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1 ×10-8 mol/L)和前列腺素E2(1×10-6 mol/L).采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞( osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能.结果 各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P＜0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P＜0-01).结论 牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显.     

缺氧诱导胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成体外初步研究

目的 通过体外研究初步探讨缺氧可以诱导胶质瘤细胞逆分化形成肿瘤干样细胞.方法 ①采用CD133+细胞免疫磁珠分选法分离胶质瘤细胞得到CD133-细胞群.②缺氧处理CD133-细胞48 h后行免疫荧光染色鉴定肿瘤干细胞样标记蛋白(SOX2,OCT-4,KLF-4,Nanog,CD133)表达情况,并分别缺氧处理0、3、6、9、12、24 h及0、12、24、48、72 h行qRT-PCR及Western blot检测.流式细胞术检测胶质瘤细胞缺氧培养后CD133+细胞比例变化,检测时间为缺氧培养1、3、5、7d.③缺氧处理胶质瘤细胞1、3、5、7d后流式分析细胞周期及凋亡改变.结果 ①荧光检测结果表明,肿瘤干细胞样标记蛋白在CD133-胶质瘤细胞缺氧处理48 h后高表达;qRT-PCR及Western blot检测结果表明,缺氧处理胶质瘤细胞可以明显上调肿瘤干细胞样蛋白表达(P＜0.05),其中qRT-PCR显示SOX-2,OCT-4及Nanog最高表达在缺氧后9h,KLF-4及CD133在缺氧后12h表达最高.Westem blot蛋白检测显示OCT-4最高表达在缺氧后12 h,CD133表达最高在缺氧24h后,KLF-4及Nanog最高表达则在缺氧48 h后,SOX-2在缺氧72 h后表达量最高.另外随着缺氧时间的延长,CD133+细胞数比例逐渐升高(P＜0.05).②细胞周期结果提示缺氧处理肿瘤细胞后,Go/G1期延长,G2/M+S缩短(P＜0.05);凋亡结果提示常氧培养组更易凋亡(P＜0.05).结论 缺氧可以诱导CD133-胶质瘤细胞肿瘤干样细胞形成.