siRNA抑制人膀胱癌T24细胞株VEGF 的表达及细胞增殖

目的探讨siRNA（small interfering RNA）对T24人膀胱癌细胞株VEGF基因表达的抑制及癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法体外构建两个针对VEGF基因的siVEGF的重组质粒，转染124细胞；应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定VEGF基因的表达，并用MTT法和流式细胞仪检测siVEGF对细胞的增殖抑制率和凋亡的影响。结果构建的两个siVEGF重组质粒分别使VEGF基因表达下调到空白组的21．02％和30．13％；control siRNA组的VEGF基因表达与空白组无明显差异。转染siVEGF后T24细胞生长受到抑制，并发生细胞凋亡，凋亡率分别为45．5％和35．9％。结论siVEGF可以有效抑制124细胞株中VEGF的表达，从而抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。     

慢病毒载体介导siRNA对裸鼠移植人肺腺癌A549抑瘤作用的实验研究

目的研究慢病毒载体介导siRNA抑制survivin基因表达后对人肺腺癌A549细胞体内增殖能力的影响以及对裸鼠移植人肺腺癌的抑瘤活性。方法应用裸鼠成瘤实验测定致瘤能力的改变，采用RT-PCR和Western-blot测定干扰后survivin基因及其蛋白的表达水平；流式细胞术检测肺癌细胞凋亡指数和增殖指数。结果靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达，使survivin-mRNA表达减少50％-80％，蛋白表达减少60％；流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高（P〈0．01），降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论RNA干扰survivin基因表达后明显抑制了人肺腺癌A549细胞的体内增殖能力；siRNA介导的survivin基因下调可明显抑制肿瘤细胞在体内的生长。     

白三烯受体拮抗剂对胃癌细胞VEGF表达影响的实验研究

目的观察白三烯受体拮抗剂对人胃癌BGC-823细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法将白三烯受体拮抗剂孟鲁斯特及环氧化酶阻滞剂阿司匹林设置不同的作用浓度和作用时间与人胃癌BGC-823细胞共培养。采用MTT比色法检测胃癌细胞抑制率，ELISA方法检测胃癌细胞血管内皮细胞生长因子的表达。结果白三烯受体拮抗剂孟鲁斯特可明显抑制胃癌细胞BGC-823的生长，孟鲁斯特100、200μmol／L作用72h后人胃癌BGC-823细胞VEGF表达率与阴性对照组相比明显降低（P〈0．05），并且随着药物浓度的升高VEGF表达逐渐减弱。结论白三烯受体拮抗剂能够抑制胃癌BGC-823细胞的增殖，该作用可能与抑制肿瘤血管生成途径有关。     

外源基因转染对大肠癌细胞及放射敏感性的影响

目的探讨p16基因转染对大肠癌细胞生长及对放射敏感性的作用。方法以脂质体介导外源性P16基因转染大肠癌SWWC细胞系,照射后MTT法测定OD值,计算细胞生长抑制率。结果p16基因转染大肠癌SWWC细胞发生周期阻滞,照射后转染组细胞生长抑制率增加,与对照组有明显差异。结论p16基因转染对大肠癌SWWC细胞具有明显抑制作用,可提高大肠癌细胞对放射的敏感性。     

抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响

本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响.选择THP-1细胞特有的m11-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段.以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RTPCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平.结果表明siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,m11-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变.结论利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.     

Caspase 3 siRNA抑制关节软骨细胞的凋亡

背景:到目前为止,国内外对caspase 3抑制剂的研发大都集中在肽类或非肽类化合物的合成和发现上,而利用RNAi干扰技术直接沉默caspase 3基因,在基因水平抑制软骨细胞凋亡还未见报道.目的:利用慢病毒载体,把Caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使其caspase 3基因沉默,相对阻断凋亡效应的联级反应,期望达到抵抗软骨细胞凋亡的目的.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-06/2009-06在暨南大学医学院附属广州市红十字会医院,广州市创伤外科研究所完成.材料:软骨细胞从SPF级SD大鼠关节中提取,caspase 3 siRNA慢病毒载体为实验构建.方法:构建大鼠pSIH1-H1-copGFP-Caspase 3 siRNA表达质粒,使用慢病毒包装系统,在293TN细胞中进行包装生产含caspase 3 siRNA的慢病毒颗粒,然后转导(transduce)入大鼠软骨细胞.主要观察指标:实时荧光定量-聚合酶链反应和Western blot检测转导后软骨细胞caspase 3 基因沉默情况,再用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡,流式细胞技术Annexin V/ PI检测软骨细胞凋亡情况.结果:Caspase 3 siRNA能顺利转入软骨细胞,转导率达90%;实时荧光定量-聚合酶链反应检测软骨细胞中Caspase 3 mRNA的表达量,实验组低于与对照组差异有显著性(P < 0.01);Western blot检测软骨细胞的Caspase 3蛋白表达量,实验组低于与对照组差异有显著性意义(P < 0.01);在使用肿瘤坏死因子α诱导软骨细胞凋亡时,caspase 3 siRNA转导组抑制细胞凋亡的能力是对照组的7倍.结论:利用慢病毒载体把caspase 3 siRNA转入软骨细胞,使软骨细胞的caspase 3 基因沉默,可以达到相对拮抗软骨细胞凋亡的目的.     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制膀胱癌EJ细胞增殖及转移

目的探讨慢病毒介导的Clusterin（CLU）基因沉默的RNA干扰效果及其对膀胱癌EJ细胞增殖和转移的影响。方法构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,用Westernblot检测其对膀胱尿路上皮癌细胞株EJ的干扰效果,用MTT、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验等方法分别检测CLU沉默后膀胱癌EJ细胞在增殖、侵袭和转移等方面的细胞生物学改变。结果靶向CLU基因的慢病毒干扰载体感染膀胱癌EJ细胞后,CLU基因在蛋白水平的表达明显下降。EJ细胞的增殖、侵袭和转移能力均受到抑制。结论 CLU慢病毒干扰载体可有效沉默膀胱癌EJ细胞内源性CLU基因,抑制膀胱癌EJ细胞的增殖、侵袭和转移。     

丙酮酸脱氢酶激酶4在膀胱癌化疗耐药中的作用

目的探讨丙酮酸脱氢酶激酶4(PKD4)在膀胱癌化疗耐药中的作用。方法通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测膀胱癌耐药细胞253J/DOX细胞株及人膀胱癌253J细胞系中PKD4的表达差异;通过siRNA转染降低253J/DOX细胞中PKD4的表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞半抑制浓度(IC50)的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞抗凋亡蛋白(Bcl-2蛋白)表达的变化情况。结果 qRT-PCR结果显示,PKD4在253J/DOX膀胱癌耐药细胞表达明显高于人膀胱癌253J细胞系,差异有统计学意义(P<0.05);MTT结果显示,相对于阴性对照组,干扰PKD4的253J/DOX细胞株的IC50明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);凋亡检测结果显示,在相同剂量化疗药物作用下,干扰PKD4后253J/DOX细胞凋亡率明显高于阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,干扰PKD4表达可明显降低Bcl-2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PKD4在膀胱癌化疗耐药细胞表达中明显升高,干扰PKD4表达可明显影响膀胱癌耐药,可考虑将PKD4作为治疗膀胱癌化疗耐药的重要分子靶标。     

siRNA靶向抑制铜绿假单胞菌oprM基因表达

目的：探讨siRNA能否抑制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）主动外排系统oprM基因的表达。方法针对oprM基因序列设计合成3对siRNA片段,分别转化耐药PA ,采用抗菌素药物敏感试验筛选出能抑制PA耐药的siRNA片段及其最佳转化剂量,再构建siRNA质粒表达载体,转化PA标准菌株,应用western blot技术检测OprM蛋白表达量的变化。结果筛选出一对能抑制PA耐药的siRNA片段,确定其最佳转化剂量为25μL（20μm／L）／100μL PA 菌液。成功构建了靶向oprM基因的siRNA质粒表达载体。Western Blot检测结果显示,转化siRNA质粒载体的PA其OprM蛋白的表达量明显降低。结论靶向oprM基因的siRNA能够抑制PA oprM基因的表达。     

siRNA对人食管鳞癌EC9706细胞中桩蛋白表达的影响

目的:探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人食管鳞癌EC9706细胞中桩蛋白(paxillin)表达的抑制作用.方法:使用paxillin siRNA 转染人食管鳞癌EC9706细胞,以对照 siRNA 转染组和正常 EC9706 细胞组为对照,采用免疫细胞化学SP法、Westem blot和半定量RT-PCR技术分别检测转染前后上述各组细胞中paxillin蛋白和mRNA的表达.结果:转染paxillin siRNA后,免疫细胞化学结果显示,3组细胞中paxillin siRNA转染组中paxillin蛋白阳性表达细胞数最低,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot及RT-PCR结果显示,与正常EC9706细胞组及对照siRNA转染组相比,paxillin siRNA转染组中的paxillin蛋白及mRNA的表达量明显下调,差异有统计学意义(P<0.05).结论:paxillin siRNA能有效抑制人食管鳞癌EC9706细胞中paxillin基因的表达.     

靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体（pSUPER-SSH1L）。方法将设计好的SSH1L的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-SSH1L真核表达载体。对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序;通过Westernblot检测SSH1L蛋白的表达。结果酶切鉴定、DNA测序以及Westernblot检测结果证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向人SSH1L基因表达的siRNA干扰质粒载体pStrPEn-SSH1L,为进一步运用RNA干扰技术进行SSH1L基因功能研究奠定了基础。     

Stathmin特异性siRNA表达质粒抑制stathmin的表达

目的:构建微管解聚蛋白stathmin基因的特异性siRNA质粒表达载体,以便研究stathmin在鼻咽癌中的生物学作用。方法:合成stathmin特异性DNA片段,退火形成的双链DNA片段克隆于质粒表达载体pGenesil-1.3;载体经扩增后,进行酶切和测序鉴定;采用QIAGEN公司脂质体(effectenetransfectionreagent)将鉴定后的重组质粒转入鼻咽癌CNE2细胞;RT-PCR与Westernblot检测stathmin基因表达。结果:酶切和测序分析表明,插入siRNA质粒表达载体中的DNA片段,其碱基序列和插入方向正确。表达分析证实特异性siRNA质粒表达载体能有效抑制鼻咽癌CNE2细胞中stathmin的表达。结论:构建的siRNA质粒表达载体对stathmin的表达有很好的抑制作用。