核糖核酸干扰抑制P-糖蛋白在大鼠耐药星形胶质细胞中过度表达

目的 利用腺病毒载体介导的短发夹RNA(shRNA)抑制大鼠多药耐药基因mdr1b及其编码的P-糖蛋白(Pgp)的表达,探讨其改善癫疴耐药现象的可行性.方法 通过同源重组方法构建腺病毒,表达针对mdr1b的shRNA,感染马桑内酯诱导的耐药星形胶质细胞模型.实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测感染5 d内细胞mdr1b和Pgp的表达,流式细胞术检测罗丹明泵出率.结果 得到6×1010pfu/ml滴度的重组腺病毒,转染星形胶质细胞后,细胞mdr1b和Pgp表达明显被抑制,干扰率达94%(P<0.01).Ads-EGFP-shRNA1-U6感染组细胞罗丹明泵出率15.8%,明显低于对照组(56.2%,F=127.5,P<0.05).结论 成功构建针对大鼠mdr1b的RNAi腺病毒载体,并在体外证实其对大鼠mdr1b表达的高效抑制作用,为进一步探索难治性癫癎的基因治疗奠定基础.     

抗癫痫药体外诱导鼠星形胶质细胞多药耐受基因P-糖蛋白的表达

目的：了解常用抗癫痫药（AED）对大鼠大脑上 星形胶质细胞多药耐受基因（MDR1）的诱导作用,探讨难治性癫痫的耐药机制。方法：给予不同浓度的苯巴比妥钠（PB）、苯妥英钠（PHT）、卡马西平（CBZ）和丙戊酸钠（VPA）持续作用于培养的新生鼠大脑皮质星形胶质细胞,分别在给药后10、20和30d,用免疫细胞化学法检测MDR1的标志物P－糖蛋白（Pgp)的表达率。结果,无药物作用的正常星形胶质细胞Pgp的表达率在各时点均小于5％,低浓度组各药在各时点Pgp的表达率与对照组比较差异无显著意义,有效血药浓度组仅PB20mg/L,PB40mg/L和PHT20mg/L在30d时Pgp表达增强;给药后10d,高浓度组各药Pgp表达率无明显增高;20d时PB、PHT和VPA组Pgp表达增强;30d时4种AED均有Pgp表达增强。结论AED可以诱导MDR1表达增强,且与剂量和时间相关。AED诱导的MDR1表达增强可能参与了难治性癫痫的形成。     

左乙拉西坦和传统抗癫痫药体外诱导大鼠星形胶质细胞P糖蛋白表达的研究

目的研究左乙拉西坦(LEV)和传统抗癫痫药(AEDs)丙戊酸钠(VPA)、卡马西平(CBZ)对大鼠皮质星形胶质细胞P-糖蛋白(P-gp)的表达的影响。方法不同浓度(1、10、50、100μg·m L-1)的VPA、CBZ及LEV持续作用于培养的正常新生鼠大脑皮质星型胶质细胞,分别在给药后10、20和30d,用免疫细胞化学法检测P-gp的表达率。结果对照组即无药物作用的正常星形胶质细胞P-gp表达率在各时点均小于5%;CBZ组100μg·m L-1在20d,30d较对照组表达增高(P0.05),20d与30d两组间比较,P0.05,其他浓度与对照组比较P0.05;VPA组100μg·m L-1在30d时较对照组表达增高(P0.05),较20d时表达增高(P0.05),其他浓度较各时点对照组比较,P0.05。LEV组在各浓度,不同时点与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论高浓度CBZ、VPA可诱导星形胶质细胞P-gp的表达,而LEV不能诱导星形胶质细胞P-gp表达。     

GSTP1通过调节JNK通路抑制癫痫大鼠海马区星形胶质细胞炎性激活

目的 明确谷胱甘肽硫转移酶P1(GSTP1)对星形胶质细胞炎性激活的影响及相关分子机制。方法 10周龄雄性SD大鼠采用腹腔注射氯化锂建立癫痫模型(n=8)并收集海马区脑组织。大鼠原代星形胶质细胞给予不同浓度脂多糖(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)诱导处理48 h。利用蛋白质印迹检测组织与细胞中GSTP1、JNK、p-JNK蛋白表达水平,以酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-1β、IL-6浓度,以高效液相色谱测定谷氨酸(Glu)浓度。将GSTP1过表达载体瞬时转染至脂多糖诱导星形胶质细胞,并给予茴香霉素处理,观察星形胶质细胞炎性激活情况。结果 癫痫大鼠海马区脑组织中GSTP1蛋白表达水平低于正常大鼠,而p-JNK蛋白表达水平与TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度高于正常大鼠(P<0.05)。GSTP1与p-JNK蛋白表达水平呈负相关(P<0.05)。脂多糖诱导星形胶质细胞炎性激活,表现为GSTP1蛋白表达水平呈剂量依耐性降低,而p-JNK蛋白表达水平与TNF-α、IL-1β、IL-6、Glu浓度呈剂量依耐性升高(P&l...     

星形胶质细胞重编程诱导为神经细胞的实验研究

目的 研究在体外星形胶质细胞重编程诱导为神经细胞的方法。方法 在体外培养出生1～4 d大鼠幼仔皮层脑组织来源的星形胶质细胞。在24孔板中将提纯、鉴定过的第三代星形胶质细胞培养在聚D-赖氨酸涂层的盖玻片上,并分为诱导组与对照两组。诱导组:将Y-27632(0. 5μmol/L)、VPA(0. 5μmol/L)、SB431542(94 nmol/L)、Rep Sox(25μmol/L)这4种小分子溶入二甲基亚砜(DMSO),再加入培养基中,最终达到0. 5μmol/L,0. 5μmol/L,94 nmol/L,25μmol/L的终浓度,孵育星形胶质细胞7 d;对照组:加入相同体积的DMSO。诱导组细胞使用小分子物质孵育7 d后,更换含有生长因子BDNF、NT-3的神经元培养基培养14 d,对照组细胞于7 d后,更换同样含有生长因子BDNF、NT-3的神经元培养基培养14 d。14 d后光镜下观察各组细胞的形态变化;并采用细胞免疫荧光检测神经元标志物TUJ1、MAP2及Neu N的表达。结果 诱导组星形胶质细胞经过小分子物质重编程诱导7 d并加入神经元培养基14 d后,光镜下观察发现大部分细胞形态发生改变,饱满的胞质变得细长,有多个突起伸出且突起较长;免疫荧光检测示,神经元标志物TUJ1、MAP2及Neu N表达阳性细胞的比例(15. 6%±0. 7%)明显高于对照组(3. 2%±0. 3%),差异有统计学意义(P 0. 05)。结论 小分子化合物Y-27632、VPA、SB431542、Rep Sox可以将星形胶质细胞直接重编程诱导为神经细胞。     

沉默Cdk5对星形胶质细胞活化增殖和细胞周期的影响

目的 观察沉默细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)对星形胶质细胞活化增殖和细胞周期的影响。方法 培养及鉴定SD大鼠星形胶质细胞,设计合成针对星形胶质细胞Cdk5的小干扰RNA(siRNA),将Cdk5 siRNA转染入星形胶质细胞,通过Real-time PCR和Western blot检测沉默效率; 分为对照组及Cdk5 siRNA干预组,在不同时间点(3、6、12及24 h)采用Edu染色及流式细胞术检测细胞增殖及细胞周期情况。结果 成功利用Cdk5 siRNA沉默星形胶质细胞Cdk5; Edu染色显示Cdk5 siRNA干预组干预3、6、12 h Edu染色阳性率较对照组显著降低(P<0.01); 流式细胞术显示 Cdk5 siRNA干预组干预3、6、12 h处于S期的星形胶质细胞比例较对照组显著降低(P<0.05)。结论 沉默Cdk5可抑制星形胶质细胞的增殖及细胞周期进展,提示Cdk5在星形胶质细胞增殖过程中起到重要作用。     

RNAi抑制星形胶质细胞Cx43对缺氧/再复氧后细胞凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术对星形胶质细胞Cx43蛋白的抑制作用以及对细胞缺氧/再复氧后凋亡的影响。方法化学合成针对大鼠Cx43基因的小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)及其阴性RNA,通过脂质体转染体外培养原代星形胶质细胞,Western blot检测Cx43蛋白表达情况,MTT法检测siRNA转染对细胞的毒性作用;通过流式细胞术观察抑制Cx43蛋白对星形胶质细胞缺氧/再复氧后细胞凋亡情况的影响。结果 Western blot结果可见,转染siRNA后12h,Cx43蛋白表达开始抑制,48h抑制最明显,MTT结果显示siRNA组和脂质体组的细胞活性明显低于未转染组(P0.05),siRNA组与脂质体组未见明显区别(P0.05);流式细胞术示缺氧12h复氧不同时间,凋亡率逐渐增加,复氧48h凋亡率最高,siRNA干扰组明显低于正常对照组(P0.05)。结论 RNAi技术是研究Cx43功能的一种有效方法,siRNA转染能有效抑制星形胶质细胞Cx43蛋白表达,siRNA转染时,细胞毒性来自脂质体;siRNA抑制Cx43蛋白能够明显减轻星形胶质细胞缺氧/再复氧后的细胞凋亡。     

脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制真核表达载体构建及最佳短发夹样RNA分子筛选

目的构建并筛选大鼠胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达抑制短发夹样RNA（shRNA）真核表达载体。方法针对GFAP基因全编码序列设计并合成三对9bp茎环结构、19bp干扰序列特异性shRNA模板，体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体；通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型，脂质体介导RNA干扰分子转染，实时荧光定量RT—PCR及Wesem blot技术观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果．筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。结果序列测定证实GFAP—shRNA重组质粒真核表达载体构建成功，三对shRNA模板在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81％、63％、56％。结论高效率的GFAP—shRNA真核表达载体在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP基因表达，为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗中的应用奠定了前期基础。     

ephrinA3在脂多糖诱导的星形胶质细胞中的表达变化

目的 探讨ephrinA3在脂多糖诱导的大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的表达变化.方法 提取新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞并纯化培养,随机分为对照组和实验组,脂多糖10mg/L干预后,实验组又分为30min组、6h组、24h组、48h组和72h组,采用倒置相差显微镜观察星形胶质细胞形态学变化,MTT法检测细胞活力,AO/EB荧光染色检测细胞凋亡和坏死情况,CY3免疫荧光及Western blot方法测定不同时间点ephrinA3的表达变化.结果 在脂多糖作用的不同时间中,与对照组相比,作用24h、48h、72h的细胞存活率显著升高,凋亡率显著下降,ephrinA3表达显著升高.结论 ephrinA3在脂多糖诱导的大鼠大脑皮质星形胶质细胞中的表达增高,持续至少72h,其在中枢神经系统损伤后星形胶质细胞增殖方面起重要调控作用.     

听源性惊厥增强大鼠星形胶质细胞Cx43基因表达

星形胶质细胞之间通过缝隙连接形成偶联，其缝隙连接蛋白为Cx43。该缝隙连接对神经元兴奋时释放到细胞外的K＋起空间缓冲作用。本研究以遗传性癫痫易感大鼠P77PMC为模型，采用原位杂交的方法，观察了一次听源性惊厥后脑内星形胶质细胞Cx43基因表达的变化，结果显示，P77PMC大鼠一次听源性惊厥后在大脑皮质、海马Cx43mRNA表达呈时间依赖性增加，从惊厥后2h开始增加，4～8h达高峰，24h仍高于对照。结果表明：惊厥时，皮质和海马星形胶质细胞Cx43基因表达增强，可能有利于星形胶质细胞对神经元兴奋时释放到细胞外的K＋产生空间缓冲作用，以便维持神经辕围的的K＋平衡。     

Suppression of the multidrug transporter P-glycoprotein using RNA interference in cultured rat astrocytes induced by coriaria lactone

Abstract

The overexpression of the multidrug resistance gene (MDR-1) and its translational product p-glycoprotein (P-gp) may play an important role in pharmacoresistant epilepsy. We established the rat astrocyte model overexpressing P-gp induced by coriaria lactone and successfully nucleofected it with the siRNA-hairpin expression vector pSIREN-shuttle designed to target MDR-1B mRNA. The mRNA expression of MDR-1B gene was mostly knock down by 67.70% (p<0.01). The expression of P-gp in experimental group was significantly lower than that in negative control (p<0.05), and the rhodamine efflux ratio of experimental group (23.08%) was remarkably lower than that of negative control (78.35%, p<0.01). We first employed RNA interfering to the drug resistance reversal of refractory epilepsy and this may provide a new way for refractory epilepsy remedy.     

RNA interference targeting Akt promotes apoptosis in hypoxia-exposed human neuroblastoma cells

Overactivation of the PI3 kinase/Akt pathway plays an essential role in the development and progression of various tumors. Akt is a key component of this pathway and hyperactivated in different tumors including neuroblastoma and glioma. In the present study, we tested the therapeutic efficacy of siRNA targeting Akt in inducing apoptotic cell death in NBFL cells (a human neuroblastoma cell line) subjected to anoxia/reoxygenation (A/R), a process that has been shown to modulate growth and progression of malignant tumors. We observed that siRNA targeting Akt effectively induced apoptotic cell death in NBFL cells (as determined by TUNEL assay and activated caspase-3 immunoreactivity) under normoxic conditions, an effect that was greatly enhanced under conditions of A/R. These findings underscore the importance of Akt signaling in promoting survival of neuroblastoma cells and may have potential therapeutic applications.     

马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马NMDA受体亚单位1(NMDAR1)mRNA表达的变化

目的　探讨癫痫发病的分子机制。方法　采用原位杂交技术 ,研究了马桑内酯致痫大鼠大脑皮层、海马 N-甲基 - D-天门冬氨酸受体亚单位 1(NMDAR1) m RNA表达的变化。结果　马桑内酶致痫大鼠顶叶大脑皮层及海马齿状回 NMDAR1m RNA水平显著高于生理盐水对照组 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。结论　马桑内酯上调脑组织内NMDAR1m RNA水平 ,此可能是其致痫及惊厥易感性增加的分子机制之一     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

RNA干扰及其在胶质瘤基因治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference。RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来，RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展．发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明，针对特异性靶基因的小干扰RNA（short／small interfering RNA．siRNA）治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。[第一段]     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

癫痫状态大鼠海马HSP70mRNA及GAD67mRNA表达水平的研究

目的 研究癫痫演变过程中特定脑区选择性神经元损伤与修复机制。方法 采用分子杂交方法动态观察了马桑内酯（coriaria Lactone,CL)诱导的癫痫状态大鼠海马区早期神经元损伤标志物热休克蛋白（heat shock protein,HSP)70mRNA及谷氨酸脱羧酶（glutamin acid decarboxylase,GAD)67mRNA表达水平的变化,同时也观察了大鼠行为学及脑电图改变。结果 侧脑室注射CL后20分钟,大鼠出现连续发作的四肢抽搐伴有EEG持续性的棘慢波及尖波发放。注射CL后2小时组大鼠海马GAD67 mRNA表达水平有所降低,但HSP70mRNA变化不明显,注射CL后8小时组大鼠海马GAD67mRNA表达水平有所降低,但HSP70mRNA表达变化不明显,注射CL后8小时组大鼠海马GAD67mRNA表达水平明显低于对照组（P＜0．01）,HSP70mRNA表达水平较对照组明显增高（P＜0．01）。结论 癫痫状态期间大鼠海马区可能存在神经元损伤与修复过程,而且GABA能神经元受到不同程度的损伤。     

A majority of Huntington's disease patients may be treatable by individualized allele-specific RNA interference

Use of RNA interference to reduce huntingtin protein (htt) expression in affected brain regions may provide an effective treatment for Huntington disease (HD), but it remains uncertain whether suppression of both wild-type and mutant alleles in a heterozygous patient will provide more benefit than harm. Previous research has shown suppression of just the mutant allele is achievable using siRNA targeted to regions of HD mRNA containing single nucleotide polymorphisms (SNPs). To determine whether more than a minority of patients may be eligible for an allele-specific therapy, we genotyped DNA from 327 unrelated European Caucasian HD patients at 26 SNP sites in the HD gene. Over 86% of the patients were found to be heterozygous for at least one SNP among those tested. Because the sites are genetically linked, one cannot use the heterozygosity rates of the individual SNPs to predict how many sites (and corresponding allele-specific siRNA) would be needed to provide at least one treatment possibility for this percentage of patients. By computing all combinations, we found that a repertoire of allele-specific siRNA corresponding to seven sites can provide at least one allele-specific siRNA treatment option for 85.6% of our sample. Moreover, we provide evidence that allele-specific siRNA targeting these sites are readily identifiable using a high throughput screening method, and that allele-specific siRNA identified using this method indeed show selective suppression of endogenous mutant htt protein in fibroblast cells from HD patients. Therefore, allele-specific siRNA are not so rare as to be impractical to find and use therapeutically.     

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。