中国沿海贪食共生藻的形态、超微结构和分子特征

共生藻属( Symbiodinium)主要指一类与无脊椎动物或原生生物共生的甲藻,是热带和亚热带海洋生态系统常见物种.本研究从中国沿海和一艘停靠在厦门港的货轮压舱水中分离出了4株贪食共生藻(Symbiodinium voratum).贪食共生藻运动细胞较小(长9.7±1.3 μm,宽8.7±0.9 μm) ,能够产生不...     

一种快速制备甲藻细胞PCR扩增DNA模板的方法

报道了一种快速制备PCR扩增甲藻细胞模板DNA的方法。以赤潮甲藻塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）和链状亚历山大藻（Acatenella）为目标藻，对藻液预处理后直接用于PCR扩增，获得5,8S核糖体RNA基因及其两侧的核糖体RNA基因转录单元内基因间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列片段，成功测序。此方法避免了复杂的DNA提取过程。     

几种海洋微藻基因组DNA的分离提取及PCR检测

用改良CTAB法分别提取6种海洋微藻的基因组DNA,发现提取的DNA纯度、产率高(>100μg.g-1鲜重),DNA完整性好。以6种海洋微藻的基因组DNA为模板,并以5'TTCGAGCCAG3'(OPC-01)为随机引物,对PCR反应条件进行研究。结果表明,25μl反应体系中,Mg2 、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:2.0mmol.L-1、1.6U、20pmol.L-1、50ng和2.5mmol.L-1。扩增程序优化为:94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2min,循环45次,最后于72℃再延伸10min。酶切实验结果表明,6种海洋微藻的基因组DNA都能被EcoRⅠ酶切,酶切图谱呈弥散状,满足分子水平操作的要求,可直接应用于进一步的分子生物学实验。     

深圳杨梅坑海域造礁石珊瑚共生藻分类和遗传多样性研究

通过核糖体ITS(Internal Transcribed Spacer)的核苷酸序列研究了深圳杨梅坑海域20种47个造礁石珊瑚样本的共生藻。通过ITS序列分析,与GenBank上的4种不同的共生藻构建Neighbor-Joining聚类树,进行石珊瑚共生藻分类和遗传多样性分析。结果表明,该海域的造礁石珊瑚共生藻属于2种不同的种类(亚系群),19个样品属于C1亚系群共生藻,1个样品属于C15亚系群共生藻,C1和C15两个亚系群共生藻之间的遗传距离为0. 01。将深圳杨梅坑海域得到的ITS序列与NCBI数据库上的福建东山海域、广东徐闻地区的C1系共生藻进行比对,只有深圳杨梅坑海域藻类样本平均(A+T)碱基含量为49. 4%,(A+T)含量小于(G+C)含量。构建Neighbor-Joining聚类树表明,深圳杨梅坑海域石珊瑚共生藻与福建东山海域的亲缘关系较近,而与广东徐闻地区的亲缘关系较远,地理隔离是主要的因素。     

丛生盔形珊瑚的2种颜色群体共生藻组成比较

造礁石珊瑚与共生藻 Symbiodinium spp.的互利共生对维护多样性极为丰富的珊瑚礁生态系统至关重要.在受到诸如水温异常等环境胁迫时,宿主珊瑚会排出体内共生藻而导致珊瑚白化直至死亡.造礁石珊瑚群体丰富的颜色对于珊瑚适应环境有着重要的作用,即使是同种造礁石珊瑚的不同群体,它们在颜色上也会有差异.丛生盔形珊瑚 Galaxea.fascicularis 作为印度-太平洋区系常见种广泛分布于海南三亚珊瑚礁海域,不同群体的颜色相异.对绿色和褐色2种颜色的丛生盔形珊瑚群体共生藻的28S rDNA进行限制性片段长度多态性(polymerase chainreaction-restrictionfragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)分析,结果显示,该珊瑚可以与C和D系群共生藻分别或同时共生.此外,丛生盔形珊瑚2种颜色群体的共生藻组成并无显著差异,表明珊瑚群体的颜色差异与共生藻的组成并无直接联系.影响珊瑚表型颜色的因素复杂,包括珊瑚的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、珊瑚和共生藻的各种色素等,具体机理需要进一步研究.     

碱煮法:一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的实用方法

介绍了一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的方法——碱煮法。取少量海水样品(40μL)．直接经0．25mol／L艺机NaOH和99℃温育处理裂解细胞,从而得到环境样品总DNA。实验证明,该方法制备的模板DNA可用于细菌核糖体RNA、浮游植物叶绿体rbcL和浮游动物线粒体COI等基因的PCR扩增。但是,在使用通用引物扩增细菌基因时,假阳性很难避免。该法制备的模板DNA适用于扩增非细菌基因或者特异引物界定的细菌基因。该方法较传统制备方法快速、简便,样品需要量减少,适用于浮游生物分子遗传多样性研究。     

大弹涂鱼基因组DNA两种提取法的比较

采用传统的饱和酚提取法和上海生物工程公司的UN IQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒法对大弹涂鱼的总DNA进行了提取。琼脂糖凝胶电泳结果表明,得到的DNA片段分子量在21 kb以上;通过PCR扩增实验,证明了用两种方法提取的DNA均可直接用于随机扩增的DNA多态性(RAPD)遗传标记;试剂盒法具有简单、快速、高效的优点,是一种值得推荐的DNA提取方法。     

两种造礁石珊瑚共生藻分子系统分类及其对水温升高的响应研究

珊瑚白化是导致全球珊瑚礁生态系统衰退的最重要原因之一,野外观察结果表明不同种属的造礁石珊瑚对于海水温度升高的耐受性有所差异.选取多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)和丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)为研究对象,比较其共生藻在温度升高时的光生理差异.对多孔鹿角珊瑚和丛生盔形珊瑚共生藻的分子系统学研究结果表明:多孔鹿角珊瑚和丛生盔形珊瑚的共生藻属于不同系群,丛生盔形珊瑚共生藻属于D系群,而多孔鹿角珊瑚共生藻属于C1亚系群.当温度升高到30℃时并未对两种造礁石珊瑚共生藻光合系统Ⅱ造成损害,而当温度升高到34℃时两种造礁石珊瑚共生藻的F_v/F_m值急剧下降,其光合系统Ⅱ遭受损害.多孔鹿角珊瑚和丛生盔形珊瑚分别与不同系群的共生藻共生可能是导致其对海水温度升高耐受性不同的主要原因,与C1亚系群共生藻共生的多孔鹿角珊瑚对水温升高敏感,容易白化,而与D系群共生藻共生的丛生盔形珊瑚对水温升高的耐受性强,不易白化.     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

江蓠总DNA提取及其PCR扩增方法的建立

通过对CTAB法、SDS法和植物基因组提取试剂盒3种方法提取江蓠Gracilaria总DNA的得率比较,并将得到的总DNA用于限制性酶切和PCR扩增反应进行纯度检测,选择出适合江蓠属总DNA的提取方法,建立了江蓠RAPD、ISSR和ITS等遗传多样性和系统学研究的分子生物学方法.实验结果表明,SDS法和植物基因组提取试剂盒均适用于江蓠总DNA的提取;其中SDS法适用于新鲜和冰冻材料的总DNA提取,不仅得率和纯度高,且方法稳定性好,提取时间较短,在本实验中是江蓠总DNA提取的最佳方法.植物基因组提取试剂盒的得率低,但质量好,操作快速简便,适用于大量新鲜样本总DNA的提取.CTAB法由于相对耗时长且产物稳定性差,不推荐在江蓠中使用.     

黄海潮间带和浅海表层沉积物中植物DNA提取和PCR扩增的方法学探索

海洋沉积物中的植物信息具有重要的生态学和古环境意义,但传统方法只能通过研究沉积物中的孢粉获取植物信息。随着分子生物学的进步,探索利用海洋沉积物中的植物分子多样性解释全球变化成为了一种新的尝试。文章首次尝试了对海洋沉积物中的植物DNA进行提取与PCR扩增,通过使用不同的DNA提取方法(DNA提取试剂盒)和PCR扩增条件[2倍浓缩的PCR扩增预混合溶液(Mix)退火温度、循环数、DNA模板量以及引物],探索海洋沉积物中植物DNA提取和PCR扩增的方法,并在采自黄海潮间带以及浅海表层的沉积物中进行了检验。共尝试了32种方法,结果表明:强力土壤微生物DNA提取试剂盒(DNeasy PowerSoil)以及2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅠ是较好的DNA提取与扩增条件;对于潮间带表层沉积物样品,最佳退火温度为55°C,最佳循环数为55个循环;而对于浅海表层沉积物样品,最佳退火温度为59°C,最佳循环数为45个循环;此外,相对于rbcL引物, gh引物的扩增结果更好。这项研究首次成功提取并扩增了海洋沉积物中的植物DNA,以期应用于海洋沉积物中植物分子多样性的分析,为研究全球...     

采用加速溶剂萃取法提高微藻油脂萃取量的优化条件研究

设计4因子5水平的正交实验方案[采用正交表L25（5＾6）],通过确定加速溶剂萃取法（ASE）处理的最优化条件,包括萃取溶剂、萃取温度、萃取时间和萃取循环次数,达到快速萃取微藻油脂并且萃取量高的效果．结果表明,除循环次数外,其他萃取条件因子均能显著影响油脂萃取量（P〈0．035）．在萃取溶剂为无水乙醇或丙酮、温度为175℃、萃取时间为16min、循环次数为3次的最优处理条件下,微藻油脂萃取量最高（19．20％～21．36％）．与常规的索氏萃取法相比,萃取量可提高39．08％～47．09％．采用ASE法在最优化条件下萃取微藻油脂可以达到良好效果．     

硅藻粘附性EPS提取方法的比较研究

底栖硅藻是可见光能照射到的水下表面生物膜中的主要污损生物,胞外多聚物(Extracellular Polymeric Substances,EPS)是硅藻生物膜形成和发育过程中的关键物质,可溶性EPS和粘附性EPS的提取方法不同,对粘附性EPS的分离提取仍没有统一的方法。本研究选用了4种方法提取底栖硅藻(Amphora sp.)粘附性EPS:30℃水浴处理、70℃水浴处理、福尔马林-NaOH处理和阳离子交换树脂处理,研究了不同分离方法条件下,Amphora sp.粘附性EPS中各主要成分的提取量。结果表明,粘附性EPS中各主要成分普遍受提取方法的影响,其中DNA含量变化幅度最大,其次是蛋白质、总糖和糖醛酸含量,硫酸基含量受提取方法的影响最小。低温水浴处理提取效率低,高温水浴处理可能影响EPS的后续分析,阳离子交换树脂提取粘附性EPS的效果较好,但对细胞的破坏最严重,福尔马林-NaOH处理提取的EPS总量最高,提取总糖、糖醛酸的效果最好,而且没有造成严重的细胞破裂。因此福尔马林-Na OH处理是相对均衡和高效的提取硅藻粘附性EPS的方法。     

应用实时荧光定量PCR技术研究九龙江口水域米氏凯伦藻的分布

为快速精确监测九龙江口小型有毒赤潮藻的分布,本工作应用实时荧光定量PCR技术检测了2009年春(5月)、夏(8月)、秋(11月)3个季节九龙江口18个站位水样中米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)的密度.这3个季节分别对应九龙江口水域的丰水期、平水期、枯水期.结果表明,在九龙江口水中米氏凯伦藻的检出范围为未检出至2.3×104cells/dm3;其空间分布差异比较大,主要分布在厦门西港海域,其次是在高潮时的海门岛附近海域;海门岛以西水域几乎未监测到该藻的存在,仅5号站位有1个航次检出.米氏凯伦藻密度的季节分布差异也很明显,春、夏季的密度(最高检出值都达到了2.3×104cells/dm3)明显高于秋季的密度(最高检出值仅为5.4×103cells/dm3).本研究结果可为厦门西港以及九龙江口水域赤潮的研究与监测提供参考.同步进行的显微镜镜检技术没有观测到米氏凯伦藻的存在,可见在藻密度较低(低于103cells/dm3)的情况下,实时荧光定量PCR技术较传统镜检技术(检出限一般在103cells/dm3以上)可能更灵敏.该技术特异性好且操作简便,使对大样本的检测具有可行性,为实现沿岸海域赤潮的动态监测和深入研究奠定了基础.     

坛紫菜氨基酸提取工艺影响条件的优化与分析

以坛紫菜（Porphyra haitanensis）为实验材料,采用盐酸水解法和浸提法,以日立L-8900型高速全自动氨基酸分析仪为测定仪器,分别研究了坛紫菜总氨基酸（TAA）和游离氨基酸（FAA）在提取过程中各条件的不同水平对提取结果的影响.实验结果表明：（1）利用正交设计L9（34）对影响TAA提取的4个条件（藻体质量、稀释倍数、干燥温度、空白值）在3个水平上进行优化实验,藻体质量、稀释倍数对测定结果影响显著,干燥温度影响不显著;通过实验筛选出各条件的最佳水平为：藻体质量为0.050 0g,稀释3倍,干燥温度为60℃.（2）利用正交设计L16（45）对影响FAA测定的5个条件（藻体质量、提取液、提取温度、提取时间、空白值）在4个水平上进行优化实验,结果表明藻体质量、提取液、提取温度、提取时间的不同水平对测定结果均有显著影响,其中藻体质量对结果的影响最大;通过实验筛选出各条件的最佳水平为：藻体质量为0.010 0 g,提取液为去离子水,提取温度为60℃,提取时间为4 h.     

基于DNA条形码研究浙江沿海牡蛎的种类多样性及其分布特征

利用DNA条形码技术,基于线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c Oxidase Subunit I,COI)和核基因28S核糖体RNA(28S rRNA)序列鉴定牡蛎种类,研究牡蛎在浙江沿海的种类多样性及其分布特征。在浙江沿海的7个采样海域共采集550个牡蛎样品,抽取其中232个牡蛎样品进行基因组DNA的提取以及COI基因和28S rRNA基因的鉴定,共检测出3属10种牡蛎。巨牡蛎属(Crassostrea) 5种分别为熊本牡蛎(Crassostrea sikamea) 127个、福建牡蛎(Crassostrea angulata) 64个、日本巨牡蛎(Crassostrea nippona) 4个、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis) 1个和长牡蛎(Crassostrea gigas) 1个;牡蛎属(Ostrea) 2种分别为疏纹牡蛎(Ostrea circumpicta) 4个和密鳞牡蛎(Ostrea denselamellosa) 2个;小蛎属(Saccostrea) 3种分别为棘刺牡蛎(Saccostrea kegaki) 20个、多刺牡蛎(Saccostrea echinata) 8个和小蛎属未定种(Saccostrea sp.) 1个。分析结果表明:浙江沿海的牡蛎种类多样性高,并且在南北纵向和离岸远近水平方向上存在较大差异,其中熊本牡蛎和福建牡蛎为浙江沿海牡蛎的优势种。     

元素分析仪快速测定海洋沉积物TOC和TN的条件优化

报道了在优化样品前处理、燃烧温度、最小加氧量和最佳称样量的基础上,综合构建优化了直接固体进样varioMACRO cube元素分析仪同时测定海洋沉积物样品中总有机碳(TOC)和总氮(TN)的条件,即准确称取20~30 mg沉积物样品用1 mol/L盐酸除去无机碳后,直接进样在燃烧管温度960℃,次级燃烧管温度830℃,还原管温度900℃,氦气压力0.12 MPa,流量600 mL/min,氧气压力0.20 MPa,加氧量22.5 mL仪器条件下,用标准曲线法峰面积获取TOC和TN浓度。结果表明,海洋沉积物中TOC和TN测定的检出限分别为0.0508%和0.0146%,回收率分别为97.7%~100.9%和97.2%~101.1%,对4个实际外海沉积物样测定总有机碳和总氮结果的相对标准偏差(RSD)为0.83%~3.06%和1.33%~3.49%(n=12)。该方法操作简便快速、灵敏度高,具有较好的精密度和准确度,可准确可靠地用于海洋沉积物中总有机碳和总氮含量的测定。     

福建省沿海鱚属（Sillago）鱼类新纪录种——中国鱚（Sillago sinica Gao and Xue,2011）

本研究报道了在福建省晋江和厦门近海采集到的新记录种——中国鱚,将其分布区向南延伸至福建省沿海,并对采集到的中国鱚进行形态特征的重新描述,及扩增其DNA条形码.中国鱚的主要鉴别特征为：第一背鳍鳍膜具不规则的、呈弥散状的黑色斑点,由前往后逐渐稀疏;第二背鳍沿鳍条具3～4行规则的黑色斑点;侧线上鳞数为6～7;脊椎骨数为37～39.结合Gen Bank中鱚属鱼类的同源序列进行比对研究,结果显示本研究采集到的中国鱚与中国鱚模式种聚类到一起,并与其余种类明显分开,在遗传距离和氨基酸水平上与其他种类产生了明显地分化,进一步证明了DNA条形码能高效快速的鉴别鱚属鱼类.本研究为鱚属鱼类分类与研究提供理论基础,通过调查发现中国鱚主要分布在有大量淡水注入的河口区,南至韩国光阳沿海,北至中国福建省沿海,数量较少并不能形成渔汛.