再谈胶质瘤的基因治疗

Richard于1992年首先把胶质瘤的基因治疗称为分子外科治疗,随后作者也在有关著作中发表了与此相关的文章[1～3],不难看出当时对基因治疗的发展前景非常看好,认为胶质瘤是分子遗传缺陷性疾病,可用分子手段解决外科手术等传统治疗所不能解决的时代到了.然而,10年过去了,以单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpes simplex viruses-thymidine kinase, HSV-TK)基因治疗起步的胶质瘤基因治疗,虽然已经取得了长足的进步,但尚未取得当年所期望的那种突破性成果.基因治疗的有效性,迄今只能在实验动物体内得到证实,在临床上尚未见到有肯定疗效的报告,究其原因有:人与啮齿类动物的肿瘤与脑的体积比例非常悬殊;两种肿瘤组织中增殖细胞与非增殖细胞的比例也截然不同;肿瘤细胞向周边脑组织浸润方式和血脑屏障的破坏程度,人与动物也有显著差异.总之,目前基因治疗模式适合做动物实验,临床模拟性较差.从发展前景看,胶质瘤基因治疗研究依然任重道远,有望在下列几方面取得进展.     

神经胶质瘤的基因治疗

随着人们对胶质瘤发病机制中分子遗传缺陷的认识,胶质瘤的基因治疗逐渐受到关注。目前研究最多的基因治疗方案包括:自杀基因治疗,反义癌基因治疗,抑癌基因治疗,免疫基因治疗等。不同基因治疗胶质瘤的模式在动物实验及体外实验中取得一定进展,但目前各种方案均有其局限性,神经胶质瘤的基因治疗尚需进一步探索。     

重组腺病毒载体介导血管抑素基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的 研究以重组缺陷型腺病毒为载体的血管抑素基因治疗脑胶质瘤。方法 RTPCR法克隆angiostatin基因,构建携带血管抑素（angiostatin）基因的重组腺病毒载体,体外检测angiostatin的重组腺病毒载体对内皮细胞生长的抑制作用。建立皮下及脑胶质瘤大鼠模型,给予体内基因治疗。结果 克隆得到约1.1kb的angiostatin基因。构建重组腺病毒载体AdhCMV-AGS,体外试验表明,可以强烈抑制内皮细胞的生长。体内试验表明重组腺病毒可以在体内有效表达Angiostatin,并且有效抑制胶质瘤的生长,使荷脑胶质瘤大鼠存活90天以上。结论 以重组腺病毒为载体的血管抑素基因治疗脑胶质瘤效果显著,将是一种基因治疗的新策略。     

胶质瘤自杀基因治疗进展

应用基因载体可以将某些目的基因 (具有转化功能 )导入胶质瘤细胞 ,这些高效目的基因能将体内无毒或低毒的“前药”在胶质瘤局部转化为一种局部浓度高、对胶质瘤毒性作用强而全身毒副作用小的化疗药。旁观者效应则可通过增加胶质瘤细胞缝隙连接而自动放大局部化疗药的治疗效果 ,已发现cAMP可大大加强旁观者效应。削弱血 -脑肿瘤屏障以及联合基因治疗也都是实施胶质瘤自杀基因治疗的重要手段     

神经胶质瘤基因治疗的载体研究进展

神经胶质瘤基因治疗的载体研究进展杨学军浦佩玉恶性神经胶质瘤的治疗是神经外科领域的难题与研究热点，鉴于它是一种细胞基因组本身的疾病，近年来，有关治疗的研究日益集中于脑肿瘤的分子外科——基因治疗上来（１，２）脑胶质瘤基因治疗的效果有赖于良好的基因转移系统...     

恶性脑胶质瘤的基因治疗

恶性胶质瘤是最常见的颅内肿瘤 ,传统的治疗方法主要有外科手术、放疗、化疗 ,但是疗效均不甚理想。 1 992年Ｏｌｄｆｉｅｌｄ首次采用基因治疗恶性脑胶质瘤患者并取得一定疗效后 ,得到众多学者的认同和参与 ,并在全球得以深入开展。目前恶性脑胶质瘤基因治疗主要采用自杀基因 (ＴＫ、ＣＤ) ,抑癌基因 (Ｐ53、Ｐ1 6、Ｐ2 1 ) ,细胞因子免疫基因 (ＩＬ2、ＩＬ4、ＩＦＮａ)、反义基因 (ＶＥＧＦ、ＴＧＦ ａ、ＥＧＦＲ)等方法。在治疗中涉及的技术因素主要有基因的转移 ,基因治疗的策略等。现将有关内容综述如下。1　基因的转移　基因指编码蛋…     

RNA干扰及其在胶质瘤基因治疗中的应用

RNA干扰（RNA interference。RNAi）是双链RNA（double—stranded RNA，dsRNA）降解特异性靶基因转录出的mRNA。从而抑制靶蛋白表达的现象。自从二十世纪九十年代发现RNAi这一现象以来，RNAi已被广泛应用于研究基因功能、信号转导通路和基因治疗等方面。随着分子生物学、分子遗传学等学科的发展．发现了许多与肿瘤发生、发展和预后密切相关的基因。经过大量临床前期试验表明，针对特异性靶基因的小干扰RNA（short／small interfering RNA．siRNA）治疗胶质瘤是行之有效的。为基因治疗胶质瘤提供了新的思路。[第一段]     

胶质瘤基因治疗进展

胶质瘤为起源于神经胶质细胞的肿瘤,呈浸润性生长,与周围组织无明显分界,目前采用手术、放疗、化疗等措施疗效不十分理想,五年生存率仅为35%～50%[1]。手术全切率低和术后复发率高以及肿瘤细胞对放疗的辐射耐受性造成的残余病灶再次复发[2]仍是困扰神经外科医师的重要难题之一。目前许许多多的基因被用于治疗神经胶质瘤,展现了神经胶质瘤基因治疗的广阔前景。本文就胶质瘤的基因治疗的最新研究进展进行归纳和综述。     

重组腺病毒介导的p27Kip1基因治疗大鼠神经胶质瘤的实验研究

目的研究腺病毒介导的人p27Kip1基因(Ad-p27Kip1)对大鼠神经胶质瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠胶质瘤模型,随机分成3组:Ad-p27Kip1组、Ad-LacZ和对照组,分别给予Ad-p27Kip1、Lacz重组复制缺陷性腺病毒(Ad-LacZ)和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测p27和细胞周期素(cyclinD1)的表达;原位末端标记法检测细胞凋亡情况。结果Ad-p27Kip1组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),免疫荧光染色显示移植瘤p27表达明显增强(P<0.05),cyclinD1的表达受到明显抑制(P<0.05),且细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和对照组(P<0.05)。结论Ad-p27Kip1对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制可能是增强p27表达、抑制cyclinD1表达。p27Kip1有望成为胶质瘤基因治疗的新策略。     

神经胶质瘤的基因治疗策略现状和未来

神经胶质瘤基因治疗按策略可分为以杀伤肿瘤细胞细胞为目的、以纠正肿瘤细胞的生物学性状为目的和以破坏肿瘤血管为目的。RNA干扰技术和神经干细胞技术突破对胶质瘤的基因治疗策略产生强烈冲击。本文就神经胶质瘤基因治疗研究进展做简要介绍,并探讨治疗策略的未来发展方向。     

HSV-tk基因/GCV系统治疗鼠脑胶质瘤实验研究

探索ＨＳＶ－ｔｋ基因／ＧＣＶ系统对大鼠脑胶质瘤的体内外治疗效果。方法：用ＰＡ３１７细胞包装ＳＴＫ质粒,形成产病毒细胞ＰＡ３１７ｔｋ,产生假逆转录病毒颗粒,ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度。９６孔培养板接种２４孔Ｃ６细胞,２４孔Ｃ６ｔｋ＾＋细胞,４８小时后换入含ＧＣＶ的培养液,ＧＣＶ浓度按０、０．２５ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ     

反转录病毒介导的HSV-tk基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的：进行Ｃ６大鼠脑胶质瘤的基因治疗实验研究。方法：采用反转录病毒介导的基因转移和ＡＣＶ体内治疗方法进行研究。结果：构建了带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ，应用脂质体转移方法将ＧＩＮａＴＫ导入反转录病毒包装细胞ＰＡ３１７，成为产病毒细胞ＰＡ３１７ＴＫ，用带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的复制缺陷型反转录病毒感染Ｃ６细胞，命名为Ｃ６ＴＫ细胞，对ＧＣＶ和ＡＣＶ的敏感性分别高于亲本４５０倍和１０倍；成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型，并证实转染细胞Ｃ６ＴＫ的成瘤效应未改变，存活期约为１５天；而经ＡＣＶ治疗后，含有Ｃ６ＴＫ细胞的肿瘤生长明显被抑制，大鼠生存期延长为５７．８±８．０７天，尤其是采用ＰＡ３１７ＴＫ细胞混和治疗组和原位治疗组，肿瘤基本消失，大鼠生存期显著延长，混和治疗组存活１２０天以上，原位治疗组存活至７１．４±３６．１天。ｔ检验，Ｐ值均小于０．００１。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗大鼠脑胶质瘤疗效显著。     

HSV—tk基因／GCV系统治疗脑胶质瘤时的免疫反应

目的 探讨tk基因治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系。方法 将C6tk^ 与C6tk^-按0％tk^ ,10%tk^ ,30^tk^ 、50%tk^ 、100%tk^ 五种比例混合,接种于SD鼠右侧顶叶,7天后腹腔注射GCV（更昔洛韦）,剂量为30mg/kg/day,共10天。细胞接种3周后,处死动物,计算成瘤率,作病理检查,并作CD4^ 、CD8^ 的免疫组化染色。结果 50％及100％C6tk^ 组的在瘤率明显小于其余3组（P＜0．05）,病理检查发现50％及100％tk%^ 组有淋巴细胞及浆细胞浸润。免疫组化显示每一组之间均有差异,提示有免疫反应存在。结论 tk基因治疗脑胶质瘤时,可激起机体内的免疫反应,增强抗肿瘤作用,它是旁观者效应作用机制之一。     

腺病毒介导HSV-tk和反义IGF-1联合基因治疗鼠脑胶质瘤

目的　研究腺病毒介导 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 系统和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 联合基因治疗大鼠脑胶质瘤,并对其机制作初步分析。方法　利用腺病毒为载体观察联合 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 离体杀伤 Ｃ６细胞的效果, 并在大鼠脑内接种 Ｃ６ 细胞第８ 天进行 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 的原位治疗, 观察大鼠生存期变化。结果　 Ｇ Ｃ Ｖ 对转染反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 基因和ｔｋ 基因的 Ｃ６ 细胞较转染ｔｋ 基因的 Ｃ６ 细胞敏感。联合应用 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 系统和反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 原位治疗脑肿瘤比单用任何一种治疗方法效果明显, 免疫组化发现联合基因治疗组肿瘤有大量 Ｃ Ｄ＋４ 、 Ｃ Ｄ＋８ 淋巴细胞浸润。结论　反义 Ｉ Ｇ Ｆ１ 基因可增强 Ｈ Ｓ Ｖｔｋ／ Ｇ Ｃ Ｖ 杀伤肿瘤的作用。     

RV-HSV-tK-GCV系统基因治疗中的"旁观者效应"研究

目的研究反转录病毒载体(RV)-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tK)-环丙氧苷(GCV)系统中的旁观者效应.方法利用RV介导将HSV-tK基因导入C6大鼠胶质瘤细胞,在GCV存在条件下,将转导细胞C6/TK+按不同比例与同种属的野生C6细胞,不同种属的TJ905人多形性胶母细胞瘤以及C6/NeoR+TK-(转导的C6细胞,但对GCV耐药)进行混合培养,同时对旁观者效应产生机理进行探讨.结果 C6/TK+可被GCV所杀灭;C6,TJ905及C6/NeoR+TK-按不同比例与C6/TK+混合后应用GCV,均出现旁观者效应;结论转导细胞对GCV的敏感性较野生C6细胞明显增强旁观者效应的出现并非在同一细胞系的细胞中出现,介导旁观者效应的并非为可溶性因子.本文还就在反转录病毒介导的基因转移过程中tk基因突变可能导致C6/NeoR+TK-细胞的出现进行了讨论.     

hTERT Promoter/HSV-tk靶向性胶质瘤基因治疗系统的构建

目的　构建hTERTPromoter/HSV tk靶向性胶质瘤基因治疗系统。方法　采用TSS法在大肠杆菌JM 10 9中扩增 pGL2 hTERTPromoter和STK质粒。DNA提取纯化试剂盒提取细菌中生长的质粒 ,经电泳 ,紫外分光光度计检验后用HindⅢ ,ClaⅠ核酸内切酶对这两个质粒同时进行双酶酶切。琼脂糖电泳凝胶分离酶切片段 ,切取其中 8.5 ,1.7kbp两个片段长度的凝胶。凝胶DNA提取试剂盒提取其中所含DNA片断 ,T4DNA连接酶连接这两个片段 ,琼脂糖凝胶电泳检测连续结果。结果　通过连接反应获得 10 .2kbp的重组DNA片段。结论　成功构建hTERTPromoter/HSV tk重组表达单位。     

wt-p53基因联合HSV-TK/GCV对C6鼠胶质瘤杀伤作用的实验研究

目的研究wtp53基因联合自杀基因治疗恶性胶质瘤的可行性。方法体外试验以腺病毒为载体转导wtp53和HSVTK入C6鼠胶质瘤细胞,给以不同浓度的GCV,以MTT法检测细胞生存率。体内实验以C6鼠胶质瘤细胞和SD大鼠建立动物模型,原位注射腺病毒为载体的wtp53和HSVTK基因,腹腔给以GCV(15mg.kg-1day-1×14)。观察荷瘤鼠生存期;强化MRI动态监测荷瘤鼠肿瘤大小;TUNEL法检测凋亡。结果wtp53基因明显提高鼠胶质瘤细胞对HSVTK/GCV的敏感性,p53联合HSVTK基因转染C6的GCVID100=0.01μg.ml-1,而单独HSVTK转染C6的GCVID100=1μg.ml-1,约提高100倍;p53基因还可使C6细胞凋亡增加。体内p53基因联合HSVTK/GCV治疗使荷瘤鼠生存期明显延长,凋亡明显增加(P<0.001);强化MRI示4周肿瘤消失。结论p53基因和HSVTK基因的联合基因治疗可作为临床上优化自杀基因治疗方案的一种可能选择。     

CDglyTK双自杀基因杀伤C6胶质瘤细胞的体内实验研究

目的 观察CDgtyTK双自杀基因对C6实体胶质瘤生长的抑制作用. 方法 利用逆转录病毒介导的大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)融合基因转染小鼠C6实体胶质瘤,RT-PCR检测分析融合基因的表达,并观察对照组和治疗组肿瘤体积、重量、抑瘤牢及生存期的变化,同时观察其对C6胶质瘤细胞凋亡的影响,分析CDglyTK双自杀基因系统对肿瘤的抑制作用. 结果 RT-PCR检测显示逆转录病毒介导的COgtyTK双自杀基因在C6胶质瘤中有表达.对照组第4周肿瘤已长至20 mmx30 mm大小.并出现小鼠死亡现象,至第6周末全部死亡;治疗组肿瘤体积未增长,约5 mm大小.部分肿瘤消失.肉眼观察可见对照组肿瘤体积大,色红,血供丰富,治疗组肿瘤体积减小或消失.21 d后处死取瘤称重,对照组[(2.51±0.58)g]与治疗组肿瘤质量[(0.35±0.26)g]比较差异有统计学意义(P<0.05),治疗组抑瘤牢为86.1%.流式细胞仪检测可见治疗组细胞凋亡率(34.41%±5.20%)明显高于对照组(2.92%±1.30%),差异有统计学意义(P<0.05).电镜观察可见治疗组肿瘤细胞凋亡小体形成. 结论 效 CDglyTK双自杀基因联合双前药治疗能取得显著的抗胶质瘤作用.     

内皮抑素和反义/正义内皮细胞生长因子cDNA真核共表达载体构建与表达

目的构建大鼠内皮抑素cDNA和反义/正义血管内皮细胞生长因子（VEGF）cDNA真核共表达载体,并在C6胶质瘤细胞上获得表达.方法以1 d龄大鼠脑组织总RNA为模板,利用RT-PCR法从中扩增出内皮抑素和反义/正义VEGF的cDNA,并将获得的目的cDNA依次重组入真核表达载体pBudCE 4.1上.重组子经酶切、PCR及测序鉴定后脂质体法转染C6细胞,zeocin抗性筛选.Western-blot方法、免疫细胞化学法及MTT法鉴定含内皮抑素的阳性克隆子;ELISA方法检测各阳性克隆子上清液中VEGF含量. 结果构建带有目的基因的重组子经酶切、PCR和测序鉴定,产物大小及基因序列与预期值相符.经抗性筛选的含内皮抑素cDNA的阳性克隆子可分泌具有生物学活性的内皮抑素：含反义VEGF cDNA的阳性克隆子VEGF均呈低表达,其中转染有内皮抑素cDNA和反义VEGF cDNA共表达载体的克隆子的VEGF表达最低;转染有内皮抑素cDNA和正义VEGFcDNA共表达载体的克隆子的VEGF也呈低表达.结论成功地构建大鼠内皮抑素和反义/正义VEGFcDNA真核共表达载体并在C6细胞上获得表达,内皮抑素可下调VEGF在肿瘤细胞上的表达.