无饲养细胞无外源因子条件下高克隆密度 维持人类胚胎干细胞自身未分化状态

目的：建立人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养体系。方法：比较hESCs克隆种植密度对其无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养的影响,以及克隆种植密度对hESCs培养体系骨形蛋白(bone morphology protein, BMP)样诱导活性的影响。结果：在没有外源性细胞因子条件下,高克隆密度（34克隆/cm2）可以维持hESCs处于未分化状态,而低克隆密度不能维持hESCs处于未分化状态。同时, NB体系BMP样诱导活性可以被hESCs克隆种植密度所改变,高hESCs克隆密度时,培养基具有高的BMP样诱导活性。结论：高hESCs克隆种植密度可以改变自身生长的微环境,可以维持自身未分化状态,这?鱤ESCs自身未分化状态机制和简化hESCs无饲养培养体系提供了新的思路。     

牛胚胎干细胞建系的现状与展望

胚胎干细胞是能在体外培养中保持自我更新和多分化潜能的细胞。因此,牛胚胎干细胞系是基因工程、治疗性克隆、发育生物学、人类疾病动物模型研究的良好实验载体。公认的胚胎干细胞系已在小鼠和灵长类动物中建立。虽然关于牛类胚胎干细胞的报道也已有不少,但是真正的牛胚胎干细胞建系尚未获得成功。本文将综述当前牛胚胎干细胞建系的研究进展并对其中存在的问题,如胚胎分离胎龄、牛胚胎干细胞识别与鉴定、培养条件和与分化相关细胞因子和信号通路等,进行探讨并提出可能采取的解决办法。     

以高热为表现的外源性脂质性肺炎1例

脂质性肺炎（lipoid pneumonia,LP）是一种由于类脂物质在肺内集聚引起的非常见疾病［1-2］,根据脂类物质来源不同,可分为内源性脂质性肺炎（endogenous lipoid pneumonia）和外源性脂质性肺炎（exogenous lipoid pneumonia）。内源性脂质性肺炎又叫“胆固醇肺炎”或“黄金肺炎”,类脂物质由肺组织自身产生［3］,多见于未分化性结缔组织病、原发性硬化性胆管炎及肺泡蛋白沉积症［4-5］。外源性脂质性肺炎由吸入或误吸脂类物质（动物脂肪、植物油或矿物油）引起［6］,成年患者中大多数案例见于使用油性通便药物治疗便秘或者油性滴鼻液治疗鼻咽炎［7-8］。外源性脂质性肺炎的临床表现各异,老年患者多为慢性、进行性、无症状的肺部炎症［9］,有临床表现的多数较轻,以慢性咳嗽为主,极少数患者会出现胸痛、咯血、体重减轻、间断发热等［1］。本文报道1例以高热为表现的外源性脂质性肺炎。     

不同剂量碱性成纤维细胞因子对人类胚胎干细胞生长、凋亡和DNA完整性的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)浓度对人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)特性的影响.方法 建立化学限定性hESCs培养体系,以有饲养细胞培养体系作为参照,比较4、40 ng/ml和100 ng/ml bFGF对hESCs多能性标记、细胞周期、细胞凋亡和DNA完整性的影响.结果 ①低浓度bFGF(4 ng/ml)足以维持hESCs在化学限定性培养基(基础培养基DMEM/F12,N2,B27, 简称 NB 体系)中培养;②bFGF可以抑制hESCs细胞凋亡,且具有剂量依赖性,而对hESCs细胞周期没有影响;③bFGF有助于hESCs DNA完整性维持,在NB体系加入4 ng/ml bFGF时,hESCs在DNA水平上存在75个异常区域,而在加入40 ng/ml bFGF时,只存在1个异常区域.结论 高剂量bFGF有助于hESCs体外快速扩增和hESCs DNA完整性维持.提高bFGF浓度为hESCs体外培养所必需.     

β-catenin对胚胎干细胞自我更新与多能性调控的研究进展

胚胎干细胞来源于胚胎发育过程中的囊胚内细胞团,是再生医学研究中的“种子细胞”,具有自我更新能力和多能性。这种特性受到多种信号通路的调控,其中Wnt/β-catenin信号通路在此调控过程中发挥着十分重要的作用。β-catenin是一种多功能蛋白,是Wnt/β-catenin信号通路中的开关分子,其参与的调控网络在时间和空间上调控胚胎干细胞自我更新和向三胚层分化的能力。因此,明确β-catenin对胚胎干细胞自我更新与多能性的调控机制,能够为胚胎干细胞的研究和应用提供有益的借鉴。     

稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立

目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系?方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中?利用碱性磷酸酶染色?RT-PCR?免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性?结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性?核转染前后hESCs的Oct4?Sox2?Klf4?Nanog基因的表达未出现明显差异?RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上?结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究?     

人类胚胎干细胞的研究进展及其应用前景

人胚胎干细胞就其来源分为来源于囊胚内细胞群的hESCs和来源于胎儿生殖嵴的hEGCs，两都具有类似于其他哺乳动物ES细胞的形态学特征、细胞表面标志、碱性磷酸酶和端粒酶活性，经过反复传代复苏仍然保持二倍体核型和未分化状态，在体外可以分化为人体多种类型的细胞。本将就人胚胎干细胞的研究进展、应用前景及目前存在的问题作一综述。     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的 开发一种新的培养人胚胎干细胞（hESCs）的包被基质,使hESCs的培养更加简便.方法 用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5～6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力.结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态.碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色 Oct4、SSEA4、Tra-1-60 为阳性,体外分化可形成拟胚体.结论 此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径.     

基于人胚胎干细胞健康安全评价新载体的构建

常用的外源性化合物多达6至7万种,均可通过各种途径进入体内损害机体,危害人类健康。现用的国际标准中,健康安全体外评价载体仍采用微生物、动物及人类永生化细胞、肿瘤细胞或原代培养细胞,但微生物和动物不能完全反映人类的生物学特征,肿瘤细胞不是正常健康的细胞,而原代培养细胞非单一来源细胞,无法进行标准化,因此,急需建立新的生物安全性评价的体外模型。     

干细胞在发育毒性体外模型建立中的应用研究进展

干细胞是一种原始细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能。目前,由于环境和药物等外在因素的影响,畸形新生儿的比例逐年升高,建立准确、便捷、高效的发育毒性体外模型来评价预测各种化合物的发育毒性是亟待解决的难点问题。应用各类干细胞预测外在因素对机体的发育毒性,其优势远大于其他检测毒性方法。本文就近年来基于干细胞建立发育毒性体外模型的研究进行综述。     

人源饲养层对人胚胎干细胞生长的影响

【目的】 选择最佳人源饲养层,并检测不同组织来源的人源饲养层细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌情况,探讨其水平与人胚胎干细胞(hESCs)生长是否相关&#65377; 【方法】 原代培养包皮真皮&#65380;子宫内膜基质&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎儿真皮&#65380;胎儿肌肉及胎鼠成纤维细胞(MEFs);按组织来源分为7组(MEFs为对照),同期接种同一株hESCs,从饲养层细胞密度&#65380;丝裂霉素作用时间等,寻找不同饲养层适合hESCs生长的最佳条件;按人体组织分6组,ELISA方法检测各种人源饲养层细胞分泌的bFGF&#65377; 【结果】 根据饲养层细胞生长特性,饲养层从优到劣依次为:包皮&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;输卵管&#65380;胎皮&#65380;胎肌;根据hESCs生长状况,饲养层排序为:包皮&#65380;输卵管&#65380;子宫内膜&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;胎皮&#65377;输卵管&#65380;包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌&#65380;子宫内膜&#65380;胎皮分泌的bFGF(pg&#8226;10-5&#8226;mL-1)分别为13.23 ± 3.39,1.99 ± 0.17,1.40 ± 0.17,2.02 ± 1.59,0.38 ± 0.28,0.29 ± 0.29&#65377;输卵管与其它组织细胞分泌的bFGF差异均有统计学意义(P < 0.01);包皮&#65380;绒毛&#65380;胎肌之间差异无统计学意义(P > 0.05),与子宫内膜&#65380;胎皮差异有统计学意义(P < 0.05);子宫内膜与胎皮之间差异无统计学意义(P > 0.05)&#65377; 【结论】 包皮来源的饲养层最佳,输卵管细胞分泌的bFGF量最高,饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs生长无必然相关性&#65377;     

人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点

目的：诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为角质形成细胞K-hESCs（keratinocyte derived from human embryonic stem cells）, 并分析诱导过程中K-hESCs不同标志物的表达特点。方法：运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导hESCs分化为K- hESCs,通过染色体核型分析检测K-hESCs核型,通过实时定量PCR检测K-hESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）、人永生化口腔上皮细胞（human immortalized oral epithelial cells,HIOECs）、人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT的基因表达差异;利用免疫组织化学检测不同标志物在K-hESCs的蛋白表达。结果：运用上皮分化培养基成功地诱导hESCs分化为上皮样细胞K-hESCs; K-hESCs核型具有正常46条染色体,无结构异常;K-hESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于HaCaT细胞（P<0.05）,而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：运用上皮分化培养基可成功诱导hESCs分化为具有正常核型的K-hESCs;标志物的表达特点提示诱导hESCs分化为K-hESCs的过程是从hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势,最终得到的K-hESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞,该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活,处于分化初始高增殖活力阶段。     

原代人牙周膜成纤维细胞的培养及培养方法的改进

目的：探讨如何提高人牙周膜成纤维细胞原代培养的成功率。方法：组织来源于11～15岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，刮取牙根中1／3的牙周膜组织，组织贴壁培养法进行培养采用冠根分离控制取材中的污染，首次传代前进行细胞分散的方法来提高传代的成功率，并对培养细胞的形态及超微结构进行了观察。结果：经免疫组化染色证实所培养的细胞为牙周膜成纤维细胞，通过冠根分离法可有效的控制组织污染，首次传代前进行细胞分散可提高细胞传代成功率，从而使细胞培养成功率提高。结论：获得人牙周膜成纤维细胞，培养成功率在15％～20％。     

Electron microscopic observations of apoptotic cells in various etiologies of human cardiovascular diseases.

ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｓｉｎｖａｒｉｏｕｓｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓｏｆｈｕｍａｎｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｓＬｅＹｉｎｇＳｈｉｕｎｇ李英雄ａｎｄＣｈｏｕＹｕｎＹｉｎｇ...     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

UVB-irradiated human keratinocytes and interleukin-1α indirectly increase MAP kinase/AP-1 activation and MMP-1 production in UVA-irradiated dermal fibroblasts

Background Solar ultraviolet （UV） irradiation induces the production of matrix metalloproteinases （MMPs） by activating cellular signalling transduction pathways. MMPs are responsible for the degradation and/or inhibition of synthesis of collagenous extracellular matrix in connective tissues. We mimicked the action of environmental ultraviolet on skin and investigated the effects of UVB-irradiated human keratinocytes HaCaT and IL-1α on mitogen activated protein （MAP） kinase activation, c-Jun and c-Fos （AP- 1 is composed of Jun and Fos proteins） mRNA expression and MMP-1 production in UVA-irradiated dermal fibroblasts.     

外源性hbFGF cDNA导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后,能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ,并探讨其机理;为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础。方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞,经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞。用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂ     

两种牙科材料对人胚胎干细胞来源成纤维细胞的细胞毒性研究

目的:观察口腔常用材料氢氧化钙(calcium hydroxide,CH)和复合树脂对人胚胎干细胞来源成纤维细胞(embryo body fibroblasts-H9,EBf-H9)、原代培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)及小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性,探讨使用EBf-H9评价牙科材料生物安全性的可行性。方法:诱导人胚胎干细胞(H9)分化为EBf-H9,原代培养hDPCs,并经免疫细胞化学染色鉴定。用细胞计试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测比较梯度浓度CH和复合树脂浸提液对EBf-H9、hDPCs和L929细胞的细胞毒性。结果:CH或复合树脂分别作用24 h和48 h(或72 h)之后,L929细胞的存活率显著低于EBf-H9和hDPCs(P<0.05),但EBf-H9和hDPCs的细胞存活率没有统计学差异(P>0.05)。结论:对于CH和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应,提示在牙科材料生物安全性评价中,人胚胎干细胞来源成纤维细胞具有替代现有细胞检测模型的潜力。     

人鼻咽癌癌基因及其产物的研究

Oncogene of nasopharyngeal carcinoma (NPC) by means of external origin DNA transfection experiment and its gene products by immunohistochemical method have been studied. These DNAs were isolated from human primary poorly differentiated NPC tissues and were transfected into NIH/3T3 mouse fibroblasts to induce the foci of the morphologically transformed cells in the culture, while DNAs of normal placenta tissues failed to do so. The DNAs were extracted from the primary and secondary transformed cells to analyse human sequence with human Alu sequence probe. The human sequence has been detected in the DNAs of the primary and secondary transformed foci cells, while none of the human sequence was detected in the DNAs of the control. The results indicated that human transforming sequences had been integrated into transformed cells. The malignant properties of the transformed foci cells were evidenced by tumorigenic experiment of nude mice. The transformed foci cells were inoculated subcutaneously in the nude mice and induced fibrosarcoma in vivo. The tumorigenic rate was 87.5%. It was further demonstrated that DNAs from human NPC possessed carcinogenicity and induced malignant transformation. The primary result revealed that the transforming gene of NPC may be homologue to Ha-ras oncogene. The expression of Ha-ras gene products-p21 has been studied in human NPC tissues. The primary results showed a positive expression of p21 in human NPC tissues by immunohistochemical method. The positive rate was 90.4%.