成人胰岛的分离及纯化

本文作者运用自动分离方法，测定了６例健康成人非正常死亡胰岛数目，为以后的胰岛细胞培养及移植奠定基础。本研究发现成人胰腺通过胶原酶适当处理后，获得的胰岛数目多，经过Ｆｉｃｏｌｌ纯化后，胰岛纯度高，且其形态，功能保持完整，这为胰岛细胞移植提供了丰富的细胞来源。     

胰岛分离与纯化的实验研究

目的　通过改进胰岛的制备方法 ,以提高胰岛的获取数量和质量 ,从而解决可供移植的有功能的胰岛数量不足这一矛盾。方法　在经典的胰岛制备方法基础上对其加以改进 ,即在胶原酶V分离液及Fio11-40 0纯化液中加入STI与BSA -FractionV后 ,进行胰岛的分离与纯化。结果　胰岛的产量为 (1,36 0± 2 75 )EIN/胰腺 (n =8) ,纯度为 85 % ,存活率为 90 % ,胰岛的生物学活性良好。结论　改良的胰岛制备方法可大幅度提高胰岛的获取数量和质量     

大鼠胰岛分离与纯化的实验研究

0　引言　目前临床胰岛移植的效果仍不理想 ,提供理想的胰岛或胰岛细胞是发展胰岛移植的基础 .长期以来收获高纯度和高活力的胰岛或胰岛细胞是人们研究的目标 .本文采用胶原酶分次消化与葡聚糖间断密度梯度离心法来探讨大鼠胰腺胰岛的分离与纯化 .1　材料和方法1.1　胰岛分离　 SD大鼠 ,共 10只 ,不分雌雄 ,体质量 16 0～2 0 0 g.颈椎脱位法处死后 ,在无菌状态下迅速取出胰腺 ,置于4℃ Hanks液中 ,去除胰腺周围的结缔组织 ,冲洗后剪成 1mm3的碎块 ,加入 3m L预温的 1g· L- 1 的胶原酶 (IV型 ,Sigma)消化液中 ,置 38℃水浴箱中 10 min,…     

成年大鼠胰岛分离纯化的实验研究

为探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法 ,为成人胰岛细胞的分离纯化奠定基础 ,采用胰管内注射胶原酶水浴孵化以及不连续密度梯度法进行成年Lewis大鼠胰岛分离纯化 ,并对获得的胰岛细胞通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验进行功能活性检测。分离后获得 (93 8± 2 1 8)个胰岛细胞 ,染色观察胰岛细胞形态完好。纯化后获得 (80 2±1 81 )个胰岛细胞 ,平均纯度为 (68± 1 1 ) % ,纯化后细胞回收率为 (85 .9± 5 .9) % ,纯化后细胞形态完好。体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验 ,低糖情况下胰岛素分泌量为 (2 .5 3± 0 .1 8)mIU/L ,高糖情况下为 (5 .41± 0 .3 1 )mIU/L ,两者相比有极显著性差异 (P =0 .0 0 1 )。低糖刺激下C肽分泌量为 (7.5 1± 1 .0 9)ng/L ,高糖情况下为 (8.5 6± 1 .0 6)ng/L ,具有极显著性差异 (P =0 .0 0 6)。提示 :采用胰管内胶原酶灌注水浴孵化进行成年大鼠胰岛分离及不连续密度梯度法纯化可获得较多的〔(80 2± 1 81 )个〕形态及功能完好的胰岛细胞 ,为临床进行成人胰岛分离纯化打下了基础     

大鼠胰岛分离和纯化

目的观察胶原酶消化法对大鼠胰岛的分离结果.方法用胶原酶法分离、Ficoll400 密度梯度离心法纯化胰岛.用DTZ法判定胰岛的纯度;用AO/PI法判定胰岛存活率;用胰岛素释放试验和移植糖尿病大鼠法判定胰岛功能.结果纯化后的胰岛收获量为(500-700)个/每只胰腺,胰岛纯度大于85%,活度大于95%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在基础相和刺激相为(18.32±3.57)mu/L、(32.25±3.74)mu/L,差异有显著性(P＜0.05),胰岛移植后,实验组2天后血糖浓度降至正常,对照组无改变,实验组正常血糖维持时间(5.1±2.4)d.结论胶原酶消化、Ficoll400密度梯度离心法可获得高纯度和活力的大鼠胰岛.     

犬胰岛的分离与纯化

目的探讨影响胰岛分离与纯化结果的相关因素,寻找获得足够数量、高纯度、具有活性的胰岛细胞的方法,为临床胰岛移植应用提供实验基础。方法寻找自动分离技术连续分离22只犬的胰岛,连续性密度梯度离心法纯化胰岛,观察分离纯化出来的胰岛细胞大体形态、超微结构,用葡萄糖刺激释放实验检验其活性。结果纯化前胰岛计数平均为（155040±310）IEQ／胰腺,纯化后的胰岛平均计数为（74200±185）IEQ／胰腺,纯度约为（89．4±2．6）％,回收率约为（47．8±1．3）％,活率达到（93．0±1．7）％。胰岛分离纯化的结果无论在数量上还是在质量上都随着分离技术的不断更新,操作技术的娴熟而有很大提高。葡萄糖刺激释放实验显示低糖组与高糖组比较P〈0．001,提示分离纯化后获得的胰岛功能状态良好。结论从犬中分离和纯化出足够数量的胰岛细胞,可用于临床研究。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的 探讨获得足够数量和较高纯度大鼠胰岛的分离和纯化方法.方法 采用V型胶原酶灌注消化法分离成年大鼠胰岛,Ficoll 400非连续密度梯度法纯化胰岛.双硫腙(DTZ)染色鉴定培养的胰岛细胞,锥虫蓝染色检测细胞活性.葡萄糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛细胞的功能.结果 分离纯化后大鼠胰岛平均收获量为(480±30)IEQ,纯度大于90%,活性大于90%.在低糖和高糖刺激下,胰岛素分泌量分别为(12.28±0.89)mIU/L、(19.01±1.49)mlU/L,二者相比较.差异有统计学意义(P<0.05),刺激指数为(1.55±0.01).结论 胶原酶V逆行灌注消化胰腺和Ficoll400非连续密度梯度纯化法,可获得高纯度高活率的大鼠胰岛.     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的优化胰岛细胞分离纯化的方法,提高胰岛产量、纯度和功能。方法本实验经胰管注射胶原酶、胰腺静止消化分离成年大鼠胰岛,葡聚糖离心纯化,获得胰岛细胞,进行记数和功能鉴定。结果纯化后胰岛收获量为7021±861IEQ/胰腺(IEQ=胰岛当量,一个胰岛当量为一个150μm直径的胰岛),纯度达86%;胰岛形态结构完整,胰岛素释放试验显示胰岛细胞功能良好。结论细节优化可以显著提高胶原酶消化、葡聚糖不连续梯度离心分离胰岛的效率。     

大鼠胰岛分离纯化技术的改进

目的探索成年大鼠胰岛的分离纯化理想方法,并对获得的胰岛进行体外功能鉴定。方法通过用胶原酶P液灌注分离成年SD大鼠胰岛,不连续密度梯度离心法纯化胰岛,STZ染色鉴定胰岛,AO/PI染色鉴定胰岛活率,胰岛素释放试验判定胰岛功能,光镜观察体外培养胰岛的形态学变化。结果纯化后每只大鼠胰岛收获量为(629±102)IEQ,胰岛纯度>90%,胰岛细胞活率>90%,胰岛细胞体外培养液中胰岛素含量在低糖和高糖刺激下的浓度分别为(3.701 5±0.492 0)mIU/L和(10.477 1±2.233 4)mIU/L,刺激指数为2.837 8±0.102 3,体外培养48h几乎完全贴壁,培养3周生长状况仍良好。结论分离条件把握好后,胶原酶P消化、Fi-coll400非连续密度梯度离心法可获得高纯度高活率的大鼠胰岛。     

成年猪和大鼠胰岛分离纯化的实验研究

目的 选择最佳猪、鼠胰岛的制备方法。方法 采用不贩 胶原酶消化法及不连续密度梯度纯化法。结果 选出了制备适合猪、鼠胰岛的最佳方法。结论 由于猪、鼠胰腺结构的不同，制备胰岛细胞应采取不同的消化及纯化方法。     

大鼠胰岛分离及纯化方案的改进

目的优化大鼠胰岛分离纯化条件,为糖尿病胰岛受损的发病机制研究及胰岛再生的应用提供必要材料。方法胆总管原位灌注胶原酶V消化胰腺并分离胰岛后,比较经典不连续密度梯度Ficoll离心法和Histopaque1077密度离心法纯化胰岛的效果,其间观察胰腺灌注液体积及消化时间不同对大鼠胰岛分离纯化的影响,并对纯化后的胰岛进行数量、纯度和功能的体外检测。结果 Histopaque 1077密度离心法比经典不连续密度梯度Ficoll离心法可得到更多优质的胰岛(P<0.01)。两种方法获得的胰岛在高糖刺激下释放胰岛素的能力差异无统计学意义(P>0.05)。胰腺灌注液之体积及消化时间对胰岛提取有十分重要的影响。结论 Histopaque 1077密度离心法简单易行且效率较高,有望成为纯化大鼠胰岛的首选方法,便于临床和基础研究工作的开展。     

大鼠胰岛细胞分离纯化的实验研究

目的寻找简便、高效的大鼠胰岛分离纯化方法,并对纯化胰岛细胞的基本生物学状况进行鉴定。方法采用胰管内注射胶原酶水浴消化以及Ficoll400不连续密度梯度离心法纯化,用DTZ染色计算胰岛细胞的纯度;用AO/PI染色计算胰岛细胞存活率;通过体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验和糖尿病大鼠移植判定胰岛细胞功能。结果纯化后获得(738±193)个胰岛细胞/每只胰腺,纯度为(77±13)%,纯化后细胞形态完好,活度大于95%,体外葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,低糖情况下胰岛素分泌量为(24.31±5.47)mIU/L,高糖情况下为(37.62±4.29)mIU/L,两者有显著性差异(P<0.05),胰岛移植后,实验组48h后血糖值降至正常,维持(3.9±1.7)d。结论采用胰管内胶原酶灌注进行大鼠胰岛分离及Ficoll400不连续密度梯度法纯化可获得较高纯度和活度的胰岛细胞。     

db/db小鼠的繁育及其胰岛的分离纯化

目的研究db/db自发性II型糖尿病(T2DM)小鼠的饲育方法、胰岛的分离纯化及其胰岛功能的检测。方法杂合子(+/db)采用自然交配,饲养于屏障环境中,常规全价营养饲料喂养。采用胰总管逆行灌注的方法分离胰腺,Ficoll-400密度梯度离心法纯化胰岛。结果 db/db小鼠占繁殖总数的1/2,其中以第4胎产子数最多,4胎后逐渐下降。纯化后的胰岛在倒置显微镜下呈圆形或卵圆形,纯度>90%,体外释放试验提示胰岛B细胞功能较差。结论屏障环境中db/db小鼠稳定繁殖,可成功分离出小鼠的胰岛并将其纯化。     

小鼠胰岛密度梯度离心方法的研究

目的探索最优的密度梯度离心方案,提高胰岛的纯度和得率,为胰岛移植相关研究奠定基础。方法采用雄性Balb／c小鼠作为供体分离胰岛,以0.5mg／ml胶原酶Xl灌注和消化胰腺,通过不同的密度梯度离心策略分离纯化胰岛,进行双硫腙（DTZ）特异染色法染色,显微镜下观察胰岛的纯度和得率,并通过吖啶橙（AO）／碘化丙啶（PI）染色检查分离获得的胰岛活性,最终确定最佳的密度梯度离心方法。结果Balb／c小鼠在Ficoll一1．108（4m1）、1．096（2m1）、1．069（2m1）、HBSS（2m1）,加速度1、减速度1、400r／min、4min中转1800r／min、8min离心后胰岛得率为（125±39）IEQ、纯度为（79．6±105）％,经相同条件二次梯度后得率无明显降低但纯度明显提高．达（96．2±14）％。经AO／PI染色鉴定分离胰岛活性良好。结论本研究所采用的小鼠胰岛密度梯度离心方法很有效,能稳定地获得纯度较高且数量可观的胰岛。     

安氏隐孢子虫卵囊分离纯化方法研究

目的 建立获取纯净的安氏隐孢子虫卵囊外培养模型。方法研究改进分离纯化安氏隐孢子虫卵囊的方法,采用蒸馏水稀释Sheather’s蔗糖溶液配制不同密度的蔗糖溶液,比较不同稀释比的Sheather’s蔗糖溶液漂浮卵囊的效果,并首次比较了蒸馏水和PBS稀释的Sheather’s蔗糖溶液分离纯化卵囊的活性,将两种方法分离纯化的卵囊37℃水浴1h进行脱囊率比较。结果2：1蔗糖溶液（2体积Sheather’s蔗糖溶液与1体积的蒸馏水）分离奶牛粪样中卵囊效果最好。漂浮三次即可获得大量卵囊,回收率为83．70％,三次漂浮的卵囊总数较Sheather’s蔗糖溶液高57．53％。蔗糖溶液多梯度密度纯化法纯化后的卵囊杂质较少,回收率为47．52％。蒸馏水稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊脱囊率为87．87％,PBS稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊的脱囊率为84．71％,差异无统计学意义P〉0.05）。结论2：1蔗糖溶液适用于分离安氏隐孢子虫卵囊,且用蒸馏水代替PBS稀释Sheather’s蔗糖溶分离纯化隐孢子虫卵囊其活性不受影响。可用于体外培养研究。     

兔软骨细胞的分离与培养

目的 探讨免软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右，传代培养约4～5天，细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖，异染反应主要集中在细胞集落样生长区，异染程度以原代培养最为显。结论采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。     

脂肪干细胞分离纯化方法研究进展

脂肪干细胞作为种子细胞广泛应用于组织工程中,而获得足够量的、活性高的、高纯度的脂肪干细胞是其在组织工程中应用的前提。本文综述近几年来脂肪干细胞分离纯化方法的研究进展,比较各方法的优缺点,为分离纯化出理想的脂肪干细胞提供理论依据。     

梯度离心法分离、富集、纯化新生乳鼠心肌细胞

目的:探讨体外心肌细胞的分离与培养实验方法,建立研究心脏疾病的基础实验平台。方法:取新生小鼠心脏12只,利用胰酶和胶原酶双消化6次,利用percoll密度梯度离心法离心纯化分离细胞,贴壁培养1h,分离层纤维细胞,抗体标记分离后的心肌细胞,流式细胞仪鉴定细胞纯度。结果:分离新生小鼠的心肌细胞的纯度为91.3%。结论:本方法操作简单,获得心肌细胞的分离效率高,存活时间长。