稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

设计含MluⅠ酶切位点的接头,将其连接入经KpnⅠ和BamHⅠ酶切后的质粒pCAMBIA2300-U-bi-Ocs,得到pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs。设计含有KpnⅠ和MluⅠ酶切位点的引物,以稻瘟菌基因组DNA为模板扩增得到pemG1序列。将其连接入pMD18-T得到pMD18-T-pemG1。最后,用KpnⅠ和MluⅠ从pMD18-T-pemG1切下pemG1基因片段,将其连接入pCAMBIA2300-Ubi-adaptor-Ocs的KpnⅠ-MluⅠ酶切位点,构建成稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs。用冻融法将pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs导入根癌农杆菌菌株AGL-1,再通过根癌农杆菌介导转化获得了转基因烟草株系。用PCR,Northern和Western杂交验证了pemG1基因在受体烟草基因组中的整合,转录和表达。此研究为下一步通过稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达来提高转基因烟草的抗病性打下了基础。     

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列（1138bp）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因保守序列（181bp）,将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5＇末端,以反向的方式连接到该内含子的3＇末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3＇末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

人β淀粉样蛋白基因植物表达载体的构建及转化

人β淀粉样蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)是治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的关键靶标之一.本试验利用重叠PCR技术获得2Aβ串联基因片段,并将其克隆到植物表达载体pBIDST(含双35S启动子和TEV增强子)中.用根癌农杆菌EHA105介导转化烟草,筛选获得了卡那霉素抗性植株.PCR和RT-PCR检测结果证实2Aβ基因已经整合进烟草基因组中并进行了转录.     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

烟草叶绿体转化载体的构建及转基因植株的获得

选择烟草叶绿体基因组同源片段ｒｐ１２－ｔｒｎＨ－ｐｓｈｂＡ和ｔｒｎＫ－ＯＲＦ５０９Ａ,及ａａｄＡ抗壮观霉素基因,构建烟草叶绿体转化载体ｐＴＲＺ,制备ｐＴＲＺＤＮＡ金粉子弹,通过基因枪轰击烟草幼苗叶片,经壮观霉素筛选获得了愈伤组织和转化再生植株,对烟草叶绿体转化植株进行ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,结果证明其中Ｎｏ１３,１６,２３为整入了外源ａａｄＡ的叶绿体转基植株,同时其子代呈现壮观霉素抗性ａａＤ     

普通小麦春化基因VRN3的表达分析及过表达载体构建

通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了不同发育特性的普通小麦品种VRN3基因的表达,结果表明：VRN3基因在春性品种新春2号叶片中表达呈上升趋势,在雌雄蕊分化期达到最大值,在强冬性品种京841中表达量很低;VRN3在新春2号和京841茎尖中的表达量均极低。以京841的cDNA为模板扩增VRN3基因全长,连接到pCAMBIA3301载体上,构建VRN3基因过表达载体,通过农杆菌茎尖转化法获得了转基因植株,研究结果为春化基因VRN3对小麦春化发育调控的进一步研究提供依据。     

菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。     

含硫氨基酸基因植物表达载体的构建及对百脉根的转化

在本研究中,用限制性内切酶Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ从中间载体pMD18zeolin和pMD18zein 上切下zeolin基因(约1 600bp)和γ-zein基因(约720 bp),将其定向连接在经相同酶切的质粒载体pCAMBIA1302上,构建成植物表达载体pCBzeolin和pCBzein.采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化百脉根(Lotus corniculatus L.).经过共培养、筛选分化、再生,得到抗件植株.对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测表明,γ-zein和zeolin基因已经整合到百脉根基因组中,在核酸水平得到了表达.含硫氨基酸数据分析表明,转zeolin基因植株含硫氨基酸含量极显著高于转γ-zein基因植株和对照植株的含量(P＜0.01),但转γ-zein基因植株与对照植株间差异不显著.     

GsZFP1基因植物表达载体构建及对苜蓿的遗传转化

从野生大豆中获得的具有耐旱、耐冷特性的锌指转录因子GsZFP1基因,构建到以CaMV35S为启动子、E12为增强子的植物表达载体pCEOM中,以bar基因为筛选标记基因,通过农杆菌介导法将构建的植物表达载体转化苜蓿品种农菁1号的子叶节,用含0.5mg/L草丁磷的筛选培养基进行筛选,获得了70株抗性植株,用PCR检测得到20株bar基因阳性植株,将获得的转基因植株进行GsZFP1基因的RT-PCR鉴定,获得3株RT-PCR阳性植株。结果表明,GsZFP1基因在苜蓿中得到表达。     

紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化

根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。     

盐胁迫下金花菜和紫花苜蓿试管苗的转录组分析及其耐盐基因筛选

为筛选金花菜和紫花苜蓿的耐盐基因,本研究以盐胁迫下的金花菜(JHC)和紫花苜蓿(ZHMX)试管苗为试验材料进行转录组分析。结果表明：金花菜组和紫花苜蓿组差异基因数为26722,金花菜组vs紫花苜蓿组有15850个基因下调,有10872个基因上调。金花菜组和紫花苜蓿组差异基因KEGG富集显著的Pathways有核糖体、光合作用天线蛋白、糖酵解/糖异生、光合作用、苯丙烷生物合成等。金花菜组耐盐基因有碱性亮氨酸拉链43、NAC转录因子47、ABC转运A家族成员7、晚期胚胎发生丰富蛋白2、乙烯反应转录因子ERF110等基因;紫花苜蓿组耐盐基因有WRKY转录因子、蛋白TIFY 8、转录因子MYB13、核运输因子2A、低温盐响应蛋白等基因。本试验结果可为了解金花菜和紫花苜蓿的耐盐分子机制及选育金花菜和紫花苜蓿耐盐新品种提供理论依据。     

紫花苜蓿(Medicago sativa)YABBY基因家族的生物信息学分析及其对逆境胁迫的响应

YABBY转录因子家族是植物特有转录因子,与植物形态有关,在植物响应胁迫方面也有重要的调控作用。为了研究YABBY基因家族在苜蓿抗逆性中的作用,本研究利用生物信息学对苜蓿的YABBY转录因子家族成员、分布及结构等进行分析。对苜蓿、大豆、水稻和拟南芥进行系统进化树的分析,表明该家族基因在植物中具有同源性。理化性质和结构分析表明,苜蓿中YABBY基因主要分布在第2、4、5条染色体上,苜蓿YABBY家族基因中包含5个保守结构域,其蛋白质主要以无规则卷曲的形式构成,α-螺旋、β-折叠和β-转角含量较少,启动子序列分析发现该家族存在ABRE顺式反应元件,能够响应盐胁迫及ABA(Ascisic acid)胁迫,通过基因表达模式分析,发现MsYABBY2基因响应盐、碱、干旱等逆境胁迫,推测其在抗逆境胁迫中起到关键调节作用。本研究为后续研究MsYABBY基因的抗逆机制及调控机理提供了理论基础。     

紫花苜蓿G6PDH基因的克隆与超表达载体构建

为了研究G6PDH在紫花苜蓿抗低温胁迫中的作用,以‘青大1号’紫花苜蓿为材料,利用基因克隆、RACE技术获取‘青大1号’紫花苜蓿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因,并进行生物学信息分析和超表达载体的构建。结果显示,成功克隆了一个紫花苜蓿G6PDH基因,该基因c DNA全长2 260 bp,含有1个长度为1 752 bp的开放阅读框,编码583个氨基酸。MsG6PDH与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆等序列一致性达到88%以上;在进化上,Ms G6PDH与同为豆科植物的绿豆、野大豆、大豆亲缘关系最近。经预测,Ms G6PDH蛋白二级结构中,α-螺旋占37.91%,β-折叠占5.66%,无规则卷曲占40.31%,并预测得到其三级结构。分析MsG6PDH编码的氨基酸序列得知,Ms G6PDH蛋白分子量为65.71 k D;理论等电点为8.25;不稳定系数为44.54,为不稳定蛋白,并且属于亲水性蛋白。此外,还同时成功构建了该基因的植物超表达载体pPZPY112-MsG6PDH。本研究将为明确G6PDH在紫花苜蓿响应低温的信号转导途径中的作用提供理论依据。     

紫花苜蓿愈伤组织诱导和分化研究

以紫花苜蓿SANDITI无菌苗下胚轴、茎、叶3种不同外植体,在附加不同激素浓度的MS培养基上诱导愈伤组织。结果表明,SANDIT最佳外植体为下胚轴,最佳下胚轴愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5mg/L。15 d继代1次,或适当降低2,4-D浓度,提高6-BA或KT浓度,可以降低愈伤组织褐化率。愈伤组织在6-BA0.5 mg/L,NAA 0.1 mg/L,GA31.0 mg/L,YE 250 mg/L,CH 250 mg/L的MS培养基上,可获得较高的分化率。     

紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建

根据紫花苜蓿2级标准品种Vernal PhyB基因的序列(GenBank登录号为GQ379903.1),设计2对含有酶切位点的特异性引物F1/R1和F2/R2,以紫花苜蓿总RNA为模板,通过RT-PCR法扩增得到PhyB基因正向、反向目的片段,将片段连接到pGEM-T Easy载体上得到重组载体pGEMB-1和pGEMB-2,再以中间载体pHANNIBAL和植物双元表达载体pART27为基础,通过多次酶切和连接,成功地构建了紫花苜蓿PhyB的RNAi表达载体。为进一步研究光敏色素B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定了基础。