表皮干细胞分离及基因特异性表达

目的利用Ⅳ型胶原快速黏附特性分离表皮干细胞,以基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达.方法观察表皮角质形成细胞(KCs)在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白(FN)上的黏附、生长,相差显微镜和扫描电镜观察Ⅳ型胶原快速黏附KCs形态,流式细胞仪测定细胞周期,基因芯片技术检测表皮干细胞基因特异性表达.结果KCs在Ⅳ型胶原上黏附和生长良好,Ⅳ型胶原上快速黏附的KCs形态较为原始;S期、G2/M期细胞比例分别为(2.18±1.85)%和(0.60±0.21)%,明显低于非黏附KCs的(3.92±0.99)%和(1.44±0.78)%,符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征.与原代KCs比较,黏附KCs CT-NNB1、TOB1、PP2R5E等21个增殖相关基因上调,17个下调.结论Ⅳ型胶原是表皮干细胞分离的适宜基质,在Ⅳ型胶原上快速黏附的KCs符合表皮干细胞的形态和细胞周期特征.黏附KCs CTNNB、TOB1、PP2R5E等基因表达上调,可能与表皮干细胞特性的维持有关.     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法.方法 运用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞.分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37 ℃、5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10 min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达.以角质形成细胞作为对照.结果 组织学观察显示,培养24 h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长; 免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达.结论 运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养.     

Ⅳ型胶原糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响

目的研究糖尿病患者皮肤组织中Ⅳ型胶原的糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响。方法体外培养表皮干细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光化学方法鉴定其标志物(角蛋白19和β1整合素),将表皮干细胞分别接种在包被有正常Ⅳ型胶原和糖基化Ⅳ型胶原的培养板上,比较两者黏附率、生长曲线和克隆生成率。结果糖基化Ⅳ型胶原上生长的表皮干细胞的黏附率和克隆生成率均较正常胶原组低(P<0.05)。结论Ⅳ型胶原的糖基化抑制了表皮干细胞的黏附与增殖,可能是糖尿病患者创面难愈的机制之一。     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。     

人表皮干细胞的分离与鉴定

目的分离人表皮干细胞群并鉴定其相关的分子标记蛋白的表达。方法采用传统方法和快速黏附Ⅳ型胶原的方法分离人正常角质形成细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群,并采用免疫荧光法检测整合素α6,p63蛋白在2种细胞中的表达。结果成功分离了人正常角质细胞群和快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群;快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群高表达α6整合素和p63蛋白,与人正常角质细胞群差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究分离的快速黏附Ⅳ型胶原的人角质形成细胞群是富集了人表皮干细胞的细胞群。     

Ⅳ型胶原糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响

目的 研究糖尿病患者皮肤组织中Ⅳ型胶原的糖基化对表皮干细胞生物学特性的影响.方法 体外培养表皮干细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光化学方法鉴定其标志物(角蛋白19和β1整合素),将表皮干细胞分别接种在包被有正常Ⅳ型胶原和糖基化Ⅳ型胶原的培养板上,比较两者黏附率、生长曲线和克隆生成率.结果 糖基化Ⅳ型胶原上生长的表皮干细胞的黏附率和克隆生成率均较正常胶原组低(P＜O.05).结论 Ⅳ型胶原的糖基化抑制了表皮干细胞的黏附与增殖,可能是糖尿病患者创面难愈的机制之一.     

表皮干细胞的分选鉴定及培养

目的 探讨并评价Ⅳ型胶原黏附法分离表皮干细胞的可行性.方法 以不同浓度Ⅳ型胶原及不同黏附时间对表皮细胞进行分选培养.选择0.2mg/ml、15min组细胞,进行免疫细胞化学染色鉴定.结果 黏附浓度对贴壁率影响不明显,而黏附时间的影响显著;0.2mg/ml Ⅳ型胶原黏附15min的细胞,β1整合素、K19免疫荧光细胞化学双重标记阳性细胞的比例约为28.50%.结论 Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞仅仅是一种初步的筛选,是目前组织工程产业化种子细胞的分选最可行的方法 ,但要获取高纯度的ESC需要进一步的深入研究.     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法.方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照.结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达.结论:运用Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养.     

表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性及分选方法的研究

目的 观察不同时间内表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性.方法 分别取贴壁后10、20、30、60 min的人角质形成细胞,用细胞计数器进行细胞计数,计算其直径.并用β1整合素、K19对贴壁的细胞进行鉴定.流式细胞仪检测β1整合素的阳性表达量,相差显微镜进行细胞形态学观察.结果 随着时间的延长,表皮干细胞贴壁数逐渐增多,20 min内黏附细胞数与10 min内比较差异有统计学意义(P<0.05),而与30、60 min内比较差异无统计学意义.贴壁细胞小而圆,反光能力强,整合素β1间接免疫荧光及免疫组化结果显示贴壁细胞均为阳性,K19免疫组化阳性率为31.03%,流式细胞仪测整合素β1阳性率表达量为100%.结论 20 min内Ⅳ胶原能快速黏附绝大部分表皮干细胞,细胞活力不受影响,可以用于表皮干细胞的分选.     

人表皮干细胞的体外培养与鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外分离培养方法 ,并对培养的表皮干细胞进行鉴定.方法 运用中性蛋白水解酶和胰蛋白酶两步法分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附分离角质形成细胞,应用表皮干细胞培养基进行培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫组织化学染色观察表皮干细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、CK10的表达. 结果 组织学观察显示,培养中实验组细胞呈现克隆生长,且克隆维持时间较长;免疫组织化学染色显示,实验组的培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达,而CK10阴性表达.结论 应用Ⅳ型胶原黏附和运用表皮干细胞培养基可以实现人体表皮干细胞的分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础.     

碱性成纤维细胞生长因子诱导表皮细胞去分化的初步研究

目的 初步探索表皮细胞体外去分化模型的建立方法.方法 HEKa细胞体外培养6-7代时开始出现老化迹象,细胞体积膨大,形态发生明显改变.加入浓度为100 ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导液分别培养6、12、24、48、72 h后,MTT法检测bFGF对表皮细胞体外生长的促进作用.同时采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、RT-PCR法检测bFGF诱导培养后,表皮细胞的表型及功能的改变.结果 MTT检测结果显示浓度为100 ng/ml,诱导时间为36～48 h为诱导表皮细胞去分化的最佳实验条件.在bFGF的作用之下,老化的HEKa细胞周围开始出现新生的表皮干细胞样克隆.免疫细胞化学检测结果表明,实验组细胞中β1整合素、CK19、CK14的表达增强,而CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低.流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK19表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为74.77%和15.74%);CK14表达阳性的细胞也由原来的67.26%增加至被检测细胞总数的87.14%.而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%).此外,RT-PCR检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的理论.在bFGF诱导组中,β1整合素、CK19、CK14 mRNA转录水平明显上调,而CK10 mRNA表达则明显下降.结论 bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型表皮前体干细胞,但其涉及具体机制需要进一步研究.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

表皮干细胞的分离及鉴定

表皮干细胞(epiderimal stem cells,ESCs)在体内数量很少,且缺乏特异性标志物,分离鉴定存在一定困难.目前,分离ESCs主要根据细胞动力学特点,以及特异性标志物标记后经流式细胞术分选来完成,已发现多种ESCs特异性标志物可用于其分离及鉴定.     

人表皮干细胞的分离和鉴定

目的　探索一种分离人表皮干细胞的新途径 ,为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法　以基底细胞作常规细胞培养 ;采用分类技术并结合表皮干细胞的特性 ;免疫细胞化学S P法鉴定。结果　用中性蛋白酶和胰酶消化可分离基底细胞 ,(1～2 )× 10 4/ml的基底细胞接种于以 3T3为滋养层的培养瓶内 ,以含EGF等因子的DMEM为培养液 ,2d后细胞开始增殖 ,一周许去除滋养层 ,10～ 12d可传代。异硫氰酸酯荧光素 (FITC)标记的基底细胞经流式细胞仪分选及IV型胶原 2 0min内的粘附后获得一些圆形、大小较一致的细胞。以鼠抗人K19的单抗为一抗 ,免疫细胞化学S P法呈棕黄色阳性反应 ,证实分离出的细胞为表皮干细胞。结论　通过荧光激活细胞分类和IV型胶原的粘附可分离出表皮干细胞 ,为组织工程皮肤的研究打下基础     

表皮干细胞体外诱导转分化为角膜上皮细胞的实验研究

目的探讨表皮干细胞向角膜上皮细胞转分化的可塑性.方法用Ⅳ型胶原筛选的方法培养并鉴定表皮干细胞,经体外与角膜缘基质细胞共培养诱导分化,免疫组化检测角膜上皮细胞特异标志物K12表达.结果获得的表皮干细胞表现出很强的增殖潜能,光镜下为原始细胞形态特征,能强表达K19和β1-integrin,共培养2周后可见细胞分化,细胞表达角膜上皮特征性K12.结论在本实验的体外诱导条件下,表皮干细胞能转分化为角膜上皮细胞.     

黑素瘤细胞诱导人胚上皮干细胞的恶性转化

目的:探索体外肿瘤微环境中正常成体干细胞是否可以发生恶性转化而具有相关肿瘤学特性.方法:利用共培养池建立黑素瘤A-375细胞诱导表皮干细胞转化的模型,应用相差显微镜观察诱导前后表皮干细胞形态变化,免疫荧光法检测诱导后表皮干细胞E-钙黏着蛋白、肿瘤相关抗原P53突变蛋白的表达变化和双层软琼脂实验鉴定诱导后表皮干细胞克隆形成能力情况.结果:7 d后与黑素瘤细胞A-375直接接触共培养的表皮干细胞开始克隆样生长,细胞E-钙黏着蛋白表达下降,部分细胞表达P53突变蛋白,软琼脂培养克隆形成率为0.55%.结论:表皮干细胞经黑素瘤细胞直接诱导后,可以具有肿瘤细胞的相关生物学特性.结果表明,肿瘤微环境可以造成干细胞自我更新能力的失控.     

Treatment of rabbit corneal with skin epidermal stem cells

OBJECTIVE: To construct artificial rabbit corneas with autologous skin epidermal stem cells and allogenic stromal cells in vitro and promote healing of corneal wounds. METHODS: Skin epidermal stem cells were isolated from autologous skin samples. Keratocytes were isolated from newborn cornea biopsies. The cells were combined with acellular porcine corneal stroma scaffold to construct artificial corneas. Then the constructed artificial corneas were used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells. RESULTS: Cultured skin epidermal stem cells and keratocytes were in good growth conditions. Cultured artificial corneas consisted of multiplayer epithelial cells growing on stroma equivalent consisting of stromal matrix with incorporated keratocytes. The in vitro constructed artificial corneas were histologically similar to normal rabbit corneas. Three months after transplantation, the cornea wounds were healed and the rabbit cornea became transparent. CONCLUSION: The artificial corneas were constructed successfully in vitro and can be used to repair severe vision loss caused by complete loss of corneal epithelial stem cells.     

表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异

目的:研究表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异.方法:从5例成年男性志愿者身体取头部、胸部、背部、臀部、大腿内侧、大腿外侧、上臂内侧、上臂外侧、手掌、足底、包皮及阴囊皮肤标本,采用免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织表皮干细胞标志物角蛋白19(K19)和整合素β1的表达.结果:皮肤基底层K19和整合素β1阳性细胞以包皮和阴囊最多,其次是臀部,背部及四肢近端外侧相应地多于胸部及四肢近端内侧,头皮、手掌及足底皮肤基底层阳性细胞很少.头皮毛囊隆突部及皮下腺管可见较多K19和整合素β1阳性细胞.结论:表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布存在差异,头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞,背部及四肢近端外侧皮肤基底层表皮干细胞相应地多于胸部及四肢近端内侧.