pGL3-EPO-α-MHC启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及缺氧调控功能考察

目的考察EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下的调控表达作用。方法构建pGL3-EPO-α-MHC启动子编码荧光素酶报告基因的质粒,以含pGL3-EPO-α-MHC和pGL3-CMV启动子的质粒分别转染缺氧和常氧的心肌细胞（H9C2）,检测荧光素酶的表达。结果 pGL3-CMV启动子质粒在缺氧条件下的报告基因表达与常氧条件相比显著下降（P〈0.05）,而pGL3-EPO-α-MHC启动子在缺氧条件下能够显著上调报告基因的表达4.3倍（P〈0.01）。结论 EPO-α-MHC启动子具有缺氧调控功能。     

人HOXA1 3'-非翻译区荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的:针对人同源异型盒A1(HOXA1)基因的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)构建HOXA1的荧光素酶报告基因载体,对其克隆进行鉴定并挑选出正确的克隆,为后续功能研究提供基础。方法:PCR扩增包含HOXA1 3'-UTR的DNA片段,克隆至荧光素酶载体psiCHECK-2,构建HOXA1 3'-UTR荧光素酶报告基因载体,经Not I和Xho I双酶切后测序进行鉴定。结果:克隆获得的DNA片段大小及序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。结论:成功构建了含hURAT1基因3'UTR区的荧光素酶报告载体,可用于后续功能研究。     

基于报告基因检测的β3肾上腺素受体激动剂筛选模型的建立与应用

目的：建立基于双荧光素酶报告基因检测的β3肾上腺素受体（β3-AR）激动剂筛选模型,并用于β3-AR激动剂的筛选。方法：应用免疫细胞化学法鉴定β3-AR在β3-CHO细胞上的稳定表达,并将pCRE-luc质粒与pRL-TK质粒共同瞬时转染β3-CHO细胞,建立一种基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型。通过检测报告基因萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值,来间接反映配体对β3-AR的激动活性。并以β-AR激动剂异丙肾上腺素刺激对模型的有效性进行验证,在此基础上以此模型对20种新化合物的β3-AR激动活性进行筛选。结果：β3-CHO细胞经免疫细胞化学法鉴定有特异性受体蛋白表达。通过将两个报告基因质粒转染该细胞后,与加入溶剂对照相比,加入异丙肾上腺素可显著促进荧光素酶报告基因的表达,表明该模型有效、可靠。以此模型从20个化合物中初筛出8个活性较强的β3-AR激动剂。结论：本研究建立了基于双荧光素酶报告基因检测的β3-AR激动剂筛选模型,并以此模型筛选发现了几个活性较强的β3-AR激动剂。     

Nfic 基因 3′UTR 双荧光素酶报告质粒的构建及其与 miR-20a 靶向关系的验证

摘要： 目的 构建核因子 C（nuclear factor I-C, Nfic）基因 3′非编码区（3′UTR）荧光素酶报告质粒, 利用双荧光素酶报告基因验证 microRNA-20a（miR-20a）与其潜在靶基因 Nfic 的靶向关系。 方法 通过 microRNA 靶基因预测软件 Targetscan 获取 miR-20a 与 Nfic 基因 3′UTR 潜在的互补结合位点; PCR 扩增出 Nfic 基因 3′UTR 序列, 将此序列克隆至荧光素酶报告载体 pMIR-Report Luciferase; 将重组荧光素酶报告质粒与 miR-20a mimics（ 实验组） 或 NC mimics（对照组）共同转染 293-AD 细胞, 收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测 2 组细胞的荧光素酶活性, 从而对 Nfic 与 miR-20a 的靶向调节关系进行鉴定。 将 miR-20a mimics 和 NC mimics 分别转染骨髓基质细胞系 ST2, 裂解细胞提取蛋白后采用 Western blotting 检测 NFIC 蛋白的表达水平。 结果 构建的重组荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确。 双荧光素酶报告基因检测显示, 与对照组相比, miR-20a 可以抑制 Nfic 3′UTR 报告基因载体的荧光素酶活性（P < 0.05）;Western blotting 结果显示, 与对照组相比, ST2 细胞转染 miR-20a mimics 后 NFIC 蛋白表达水平明显下调。 结论 成功构建了 Nfic 基因 3′UTR 荧光素酶报告质粒,而 miR-20a 可以直接作用于 Nfic 基因 3′UTR,抑制其荧光素酶活性。     

血清LncRNA MEG3、miR-141表达在类风湿关节炎诊断评估中的价值及与IL-6、TNF-α、RF、CRP的相关性

目的 探究血清长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)、微小RNA-141(miR-141)在类风湿关节炎诊断评估中的价值及与白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)的相关性。方法 选取2020年1月—2021年12月收治的类风湿关节炎40例作为观察组,同期体检的健康者40例作为对照组。检测2组血清LncRNA MEG3、miR-141表达及IL-6、TNF-α、RF、CRP水平,采用Pearson法分析观察组血清LncRNA MEG3、miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平的相关性,采用受试者工作特征曲线分析对类风湿关节炎的诊断效能。结果 观察组血清LncRNA MEG3表达水平低于对照组,miR-141表达水平高于对照组(P<0.01)。观察组血清IL-6、TNF-α、RF、CRP水平均高于对照组(P<0.01)。观察组血清LncRNA MEG3表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈负相关,血清miR-141表达与IL-6、TNF-α、RF、CRP水平呈正相关(P&l...