肝癌细胞株Bel-7402中侧群细胞的分离和致瘤能力

【目的】 分选肝癌Bel-7402细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性?【方法】 采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将Bel-7402细胞分为SP细胞和非侧群(NSP) 细胞2亚群?实验分组:SP组与NSP组?细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力;RT-PCR法检测SP细胞和NSP细胞的CD133?三磷酸腺苷结合盒转动蛋白G2(ABCG2)表达;流式细胞术分析细胞凋亡率;无血清培养法检测SP细胞及NSP细胞成球率;非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性?【结果】 Bel-7402细胞中分选出的SP细胞比例为(2.4 ± 0.0)%?生长曲线表明SP细胞的增殖速度快于NSP细胞(P < 0.05)?SP?NSP细胞的克隆形成率分别为(20.5 ± 2.6)%?(5.1 ± 0.9)%,两者差异明显(P < 0.05)?SP细胞ABCG2 mRNA和CD133 mRNA平均表达水平分别是NSP细胞的3.03倍(P < 0.01)和1.98倍(P < 0.01)?SP细胞凋亡率为(0.89 ± 0.23)%,低于NSP细胞 (P < 0.05)?在无血清培养基中,SP细胞成球率为(14.1 ± 1.9)%,高于NSP细胞(P < 0.05)?1 × 103?104?105数量的SP细胞形成皮下移植瘤(P > 0.05,P < 0.05,P < 0.05),而1 × 105 NSP细胞则还不能成瘤?【结论】 肝癌 Bel-7402细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞?     

甲状腺癌中类干细胞的侧群细胞的分离及鉴定

目的:研究不同甲状腺肿瘤细胞中是否存在具备干细胞特性的侧群(side population,SP)细胞,同时比较侧群细胞和非侧群(non-SP)细胞生长?成瘤及侵袭性的差异?方法:以多种人甲状腺未分化癌细胞株为对象,利用干细胞高表达ABCG2转运体,可将荧光染料Hoechst泵出胞外的特性,运用双波长流式细胞仪从不同的甲状腺肿瘤细胞株中分选出具有干细胞特性的侧群细胞,进而通过半定量PCR及免疫荧光染色比较侧群和非侧群细胞的干细胞标志OCT4及肿瘤耐药基因ABCG2?MDR1表达的情况,采用克隆形成率及细胞侵袭迁移实验比较两组细胞群的克隆形成能力和侵袭转移能力?结果:人甲状腺未分化癌细胞株中存在具有干细胞特性的侧群细胞,该群细胞高表达干细胞标志OCT4及肿瘤耐药基因ABCG2和MDR1;同时在体外培养中,此侧群细胞可产生侧群细胞和非侧群细胞;侧群细胞比非侧群细胞具有更强的体外克隆形成能力和侵袭转移能力?结论:甲状腺肿瘤细胞中存在具有干细胞特性的侧群细胞,此群细胞可生成普通的瘤体细胞,提示该群细胞可能是肿瘤耐药和复发的根源?     

侧群细胞与卵巢癌干细胞

侧群细胞(side population,sP)是一类具有干细胞特性,能够排出活性污染Hoechst33342而具有弱荧光染色特性的细胞.利用这一特性,sP细胞可以通过免疫荧光激活细胞法结合流式细胞仪被分选,目前在人、鼠多种卵巢癌细胞株及患者腹水中成功分选、鉴定、培养,证实了sP细胞的存在,并证实其与肿瘤干细胞之间存在一致性.基于对sP细胞生物学特性的研究,进一步了解肿瘤干细胞在基因调控、信号转导等方面的研究,并且为研究卵巢癌干细胞创造有价值的细胞模型.本文就sP细胞在卵巢癌干细胞中的研究进展作一综述.     

人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究

目的  分离卵巢癌细胞系OVCAR3中的侧群(SP)细胞,并观察其成瘤性和侵袭性。 方法  利用流式细胞荧光激活分选法将卵巢癌OVCAR3细胞系分成SP和非侧群(non-SP)细胞两个亚群。对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和细胞球形成实验观察其体外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力。  结果  OVCAR3细胞株中外排Hoechst33342的SP细胞占13.1％,加入维拉帕米SP细胞的比例为1.8%。SP细胞的体外克隆形成率为(46.17±23.27)％,non-SP细胞仅为(6.17±3.06)％,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05);细胞球形成实验结果显示,SP细胞能在无血清的培养液中形成细胞球,而non-SP细胞则不能;Transwell侵袭实验结果显示,SP表型细胞穿过Matrigel基底膜的细胞数为(215.9±30.9)个,non-SP表型细胞仅为(60.9±10.5)个。  结论  卵巢癌OVCAR3细胞系中存在外排Hoechst33342荧光染料的SP细胞,其成瘤性、侵袭力均强于non-SP亚群细胞,表明SP表型的肿瘤细胞在卵巢癌的生长、侵袭及转移中具有重要的地位。     

肝癌中少量侧群细胞的分离、纯化及在体内荷瘤能力

目的从侧群(side population,SP)表型细胞具有干细胞特性的角度出发,对肝癌细胞系中的SP细胞进行检测、分离和评价。方法利用SP细胞能将荧光染料Hoechst33342泵到细胞外的特性,结合流式细胞技术进行分离纯化。结果在肝癌细胞系PLC、Huh7、Hep3B、SMMC7721及1例临床肝癌组织中检测到SP细胞的比例依次为0.8%、0.3%、0.6%、0.3%、0.4%;未在HepG2中检测到SP细胞。NOD-SCID荷瘤实验发现SP细胞较非SP细胞具有更高的成瘤性。结论肝癌细胞系及标本组织含有少量的SP细胞,这些SP细胞比非SP细胞具有更强的成瘤性,为进一步分析SP细胞的肿瘤干细胞特性奠定了基础。     

NOD/SCID小鼠中A431 侧群与非侧群细胞成瘤组织中EMT相关分子的表达

目的旨在分离A431中侧群（SP）细胞及非侧群（NSP）细胞亚群,比较二者在小鼠皮下成瘤能力差异及组织中上皮间质转
化（EMT）相关分子表达。方法培养A431细胞经荧光染料Hoeehst33342染色后,流式细胞仪分选出SP细胞和NSP细胞,接
种到NOD/SCID 小鼠皮下,观察各自成瘤能力,取瘤体组织免疫组织化学染色检测EMT相关分子E-Cadherin、β-catenin、
Vimentin、AXL和Erbb3的表达。结果A431细胞系中成功分选出SP细胞,小鼠皮下成瘤迅速。在SP细胞小鼠成瘤组织周围
细胞中,E-Cadherin、Erbb3表达降低,β-catenin、Vimentin、AXL表达增高。结论A431细胞中含有SP细胞亚群,该亚群细胞具
有较强的肿瘤形成能力,且显示较强的EMT特性。
     

人膀胱癌细胞系SW780中侧群细胞的功能鉴定

目的 使用DCV荧光染料从SW780人膀胱癌细胞系中分离侧群细胞（SP细胞）,并观察该侧群细胞是否具有肿瘤干细胞样生物学特征. 方法 SW780细胞体外培养,用DCV荧光染料分析SP细胞比率.分选SP与NSP细胞群落后体外培养扩增.软琼脂克隆集落生成实验比较SP细胞与NSP细胞的体外单克隆生长能力.采用RT-PCR法比较ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1等基因表达差异. 结果 SW780细胞的SP比率为1.6％.经体外培养后SP细胞可以产生SP细胞与NSP细胞,NSP细胞只能产生NSP细胞.SP细胞体外单克隆生长率显著大于NSP细胞（P＜0.01）.半定量RT-PCR结果表明SP细胞的ABCG2、MDR1、Oct-4及Bmi-1基因表达显著高于NSP细胞. 结论 流式细胞仪激发DCV荧光染料可从人膀胱癌SW780细胞系中分离出侧群细胞,该侧群细胞具有肿瘤干细胞样生物学特征.     

侧群细胞及其在肿瘤干细胞研究中的进展

肿瘤干细胞研究已成为国内外研究热点.肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在一小部分具有自我更新及多向分化潜能的细胞,在肿瘤耐药和复发中起着关键的作用,这一部分细胞被称为肿瘤干细胞.目前肿瘤干细胞的分离、富集方法主要有:侧群细胞分选技术、细胞表面特异性分子标记筛选技术、肿瘤微球培养技术、细胞滞留标记技术、ALDEFLUOR分析技术等.侧群细胞是一小群能够将核酸染料Hoechst 33342排出,经过流式细胞检测呈Hoechst 33342低染的细胞.侧群细胞中富含肿瘤干细胞,其分选技术已作为简单有效的富集肿瘤干细胞的方法应用在肿瘤干细胞研究中.     

胃癌侧群细胞检测分选及其增殖能力的初步分析

 目的 检测和分选胃癌细胞系中的侧群细胞（side population,SP）,并对其体外增殖能力进行初步分析。方法 选择3株不同分化程度的人胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、BGC-823,以Hoechst 33342 / 碘化丙啶（propidium iodidc,PI）荧光染料双染,维拉帕米拮抗对照,应用流式细胞仪荧光激活分选法检测SP细胞比例;通过细胞生长曲线（CCK-8法）对SP细胞体外增殖能力进行初步分析。结果 3株胃癌细胞中均存在含量极少的SP细胞,比例在0.8%～2.7%之间;SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度降低而下降（2.20% vs 1. 57% vs 0.93%, P=0.023）人胃癌细胞系MKN-28来源的SP细胞体外培养1周、2周后的增殖倍数分别为22.67和290,明显高于非SP细胞培养后的13.68和124。细胞生长曲线显示,SP细胞体外增殖能力明显强于non-SP细胞及未经分选的MKN-28细胞（P=0. 044）。结论 胃癌细胞系中存在比例相对稳定的SP细胞,SP细胞比例随着胃癌细胞分化程度增高而上升。胃癌SP细胞体外增殖能力明显高于非SP细胞。     

人宫颈癌侧群细胞的分选及其生物学特性的研究

目的通过人宫颈癌细胞中侧群细胞的富集、分离和鉴定,确定其肿瘤干细胞特性,探讨以侧群细胞作为宫颈癌干细胞研究切入点的可行性。方法收集40例宫颈癌患者的手术标本,通过原代培养、流式细胞荧光激活分选法将宫颈癌细胞分为侧群(side population,SP)细胞和非侧群细胞(non-side population,NSP)2个亚群,观察2组细胞的增生和分化能力,并进行裸鼠接种以观察其成瘤能力,化疗药物顺铂以不同浓度作用于SP细胞和NSP细胞后计算细胞抑制率,以评价2组细胞对化疗药物的耐受性。结果人宫颈癌细胞中侧群细胞的比例约为2.04%±0.93%,侧群细胞的比例随分化程度的降低而下降(P<0.05)。细胞生长曲线(MTT法)显示,SP细胞的体外增生能力明显强于NSP细胞(P<0.05);行裸鼠接种时,SP细胞表现出较强的致瘤性,只需1×103个即可致瘤,其致瘤能力是NSP细胞的100倍,且成瘤时间显著缩短;化疗药物顺铂以不同浓度分别作用于SP细胞与NSP细胞24h后,SP细胞的抑制率明显低于NSP细胞(P<0.05)。结论人宫颈癌细胞中存在外排Hoechst 33342荧光染料的SP细胞,分化越差的肿瘤细胞其SP细胞比例越低。宫颈癌SP细胞体外增生能力和裸鼠成瘤能力均强于NSP细胞,对化疗药物具有较强的耐受性,具备肿瘤干细胞的特性,可作为宫颈癌干细胞研究的切入点。     

Isolation and identification of cancer stem-like cells from side population of human prostate cancer cells

It has been widely verified by various sorting methods that cancer stem cells (CSCs) exist in different types of tumor cells or tissues.However,due to lack of specific stem cell surface markers,CSCs are very difficult to be separated from some cancer cells,which becomes the key barrier of functional studies of CSCs.The sorting method by side population cells (SP) lays a solid foundation for in-depth and comprehensive study of CSCs.To identify the existence of SP in prostate cancer cell lines,we applied flow cytometry sorting by SP to cultures of prostate cancer cell lines (TSU,LnCap,and PC-3),and the cancer stem-like characteristics of SP were verified through experiments in vitro and in vivo.The proportion of SP in TSU cells was calculated to be 1.60%±0.40% (±s),and that in PC-3 and LnCap cells was calculated to be 0.80%±0.05% and 0.60%±0.20%,respectively.The colony formation assay demonstrated that the colony formation rate of SP to non-SP sorted from TSU via flow cytometry was 0.495±0.038 to 0.177±0.029 in 500 cells,0.505±0.026 to 0.169±0.024 in 250 cells,and 0.088±0.016 to 0.043±0.012 in 125 cells respectively.In the in vivo experiments,tumors were observed in all the mice on the 10th day after injecting 50 000 cells subcutaneously in SP group,whereas when 5×106 cells were injected in non-SP group,tumors were developed in only 4 out of 8 mice until the 3rd week before the end of the experiment.Our results revealed that prostate cancer cells contain a small subset of cells,called SP,possessing much greater capacity of colony formation and tumorigenic potential than non-SP.These suggest that SP in prostate cancer cells may play a key role in the self-renewal and proliferation,and have the characteristics of cancer stem-like cells.Dissecting these features will provide a new understanding of the function of prostate CSCs in tumorigenicity and transformation.     

MHCC97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察

目的:分离肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞并观察其成瘤性和侵袭性.方法:利用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞系MHCC97分成边缘群(SP)和主群(MP)细胞两个亚群. 对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤试验观察其体内外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力.结果:SP细胞的体外克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%;1×103个SP细胞可在4 wk后形成明显的皮下移植瘤(2/8),MP细胞则需1×105个才能成瘤(2/8). Transwell侵袭试验结果显示,SP表型细胞穿过人工基底膜的细胞数为(66.6±4.0)个,MP表型细胞仅为(18.2±1.9)个.结论:肝癌细胞系MHCC97中SP亚群的成瘤性和侵袭性均强于MP亚群细胞,表明SP表型的细胞在肝细胞癌的生长、转移中具有重要的地位.     

人宫颈癌组织和Hela细胞株中SP细胞水平和生物学特性的比较研究

目的：比较宫颈癌组织和Hela细胞株中多种恶性肿瘤的侧群（SP）细胞的含量和生物学特性。方法采用Altra流式细胞仪分选出宫颈癌组织原代培养6代细胞和Hela细胞株中SP细胞,检测两种细胞的表面标记和细胞周期增殖状况。结果宫颈癌组织和Hela细胞株中SP细胞水平分别为（1．62±0．48）％和（2．70±0．59）％,Hela细胞株中SP的水平明显高于宫颈癌组织,差异有统计学意义（P＜0．05）。宫颈癌组织和Hela细胞株SP细胞的生物学标记（ABCG2、CD133、CD43、P63、Ki‐67、MDR）表达率分别为：ABCG2（78．59±5．42）％vs．（80．17±3．60）％,CD133（51．55±6．29）％vs．（52．87±4．96）％,CD43（69．73±5．70）％vs．（70．68±5．44）％,P63（47．56±6．92）％vs．（48．06±5．28）％,Ki‐67（14．69±1．69）％vs．（15．33±1．38）％,MDR（58．36±11．12）％vs．（58．24±5．32）％,表达差异均无统计学意义（P＞0．05）。各细胞周期时相分布分别为：G0/G1期（94．70±1．76）％vs．（95．10±1．59）％,S期（3．25±0．99）％vs．（2．92±0．84）％,G2/M期（2．05±1．10）％vs．（1．98±0．95）％,凋亡率（4．06±0．64）％vs．（3．92±0．59）％,坏死率（1．00±0．38）％vs．（1．12±0．31）％,表达差异均无统计学意义（P＞0．05）。宫颈癌组织和Hela细胞株两组SP细胞在生物学标记和细胞周期增殖状况的表达差异均无统计学意义（P＞0．05）。结论宫颈癌组织和Hela细胞株中都存在SP细胞且含量不同,他们均具有肿瘤干细胞的生物学特性。     

原代大鼠边缘群肝细胞的分离及端粒酶活性分析

目的:通过检测端粒酶活性(TMA)在原代大鼠边缘群及非边缘群肝细胞中表达差异,探讨边缘群细胞是否具有肝脏干细胞的部分特征. 方法:原位两步胶原酶法分离大鼠肝细胞. 应用流式荧光激活细胞分选术(FACS)将肝细胞分成边缘群(SP)及非边缘群(Non-SP),并定量分析两群细胞中TMA水平. 结果:存在SP细胞并占细胞总体2.1%,SP细胞TMA高于Non-SP细胞(28.1±1.3 vs 2.0±0.2 TPG,P＜0.01). 结论:大鼠边缘群肝细胞具有更强的自我更新能力,即具有干细胞的部分特征.     

人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞亚群的分选及其干细胞特性分析

目的: 分选人肺腺癌细胞系(LAC)中SP细胞(side population cells)亚群并分析其具有的干细胞特性?方法:运用流式细胞荧光激活分选技术(FACS)分选LAC中SP细胞亚群和非SP细胞亚群,利用MTT?体外克隆形成和皮下移植瘤试验分析其体内?外增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期及细胞分化,RT-PCR方法检测其ATP结合盒转运蛋白(ABCG2)基因的表达情况?结果:流式细胞荧光激活分选结果显示:LAC中含有约1.88%的SP细胞亚群?MTT和体外克隆形成试验表明:SP细胞亚群的体外增殖能力显著强于非SP细胞亚群?同时,裸鼠皮下接种SP细胞亚群,其体内成瘤能力也要显著强于非SP细胞亚群?流式细胞仪分析结果表明:SP细胞亚群的G0/G1期比例显著高于非SP细胞(P < 0.05)?细胞分化实验结果表明:两个亚群中SP细胞比率分别为(1.46±0.08)%和(0.12±0.04)%?RT-PCR结果显示:ABCG2基因mRNA在SP细胞亚群中的表达水平是其在非SP细胞亚群中的3.3倍(P < 0.05)?结论:利用LAC中SP细胞亚群具有肺癌干细胞的特性,流式细胞荧光激活分选肺腺癌SP细胞亚群可能是分离肺腺癌干细胞的有效方法?