多药耐药蛋白4与直肠癌放疗敏感性关系的初步研究

目的探讨多药耐药蛋白4（MRP4）与直肠癌放疗敏感性之间的关系。方法收集2000年1月至2009年1月期间95例进展期直肠癌患者放疗后进行手术的临床资料．采用免疫组织化学方法检测存档蜡块组织MRP4及P53蛋白表达．通过Logistic回归分析寻找直肠癌放疗的敏感因素。结果95例患者中有40例（42％）对放疗敏感,其中有10例（11％）患者达到病理完全缓解,有55例（58％）患者对放疗不敏感。MRP4低表达者放疗敏感率为66．7％（24／36）,高于MRP4高表达者（29．1％,16／59）（P〈0．05）;P53低表达者放疗敏感率为63．9％（23／36）,高于P53高表达者（28．8％,17／59）（P〈0．01）。长程放疗者的放疗敏感率为83．3％（20／24）,高于短程和中程放疗者[（31．3％,5／16）和（27.3％,15／55）]（P〈0．01）。多因素回归分析显示：放疗方案、P53及MRP4蛋白表达均是影响直肠癌放疗敏感性的独立因素（P〈0．05）。结论MRP4可作为直肠癌术前放疗敏感性预测的指标之一。     

多药耐药蛋白4与直肠癌放疗敏感性关系的初步研究

目的 探讨多药耐药蛋白4 (MRP4)与直肠癌放疗敏感性之间的关系。方法 收集2000年1月至2009年1月期间95例进展期直肠癌患者放疗后进行手术的临床资料,采用免疫组织化学方法检测存档蜡块组织MRP4及P53蛋白表达,通过Logistic回归分析寻找直肠癌放疗的敏感因素。结果 95例患者中有40例(42％)对放疗敏感,其中有10例(11％)患者达到病理完全缓解,有55例(58％)患者对放疗不敏感。MRP4低表达者放疗敏感率为66.7％ (24/36),高于MRP4高表达者(29.1％,16/59) (P＜0.05);P53低表达者放疗敏感率为63.9％( 23/36),高于P53高表达者(28.8％,17/59) (P＜0.01)。长程放疗者的放疗敏感率为83.3％ (20/24),高于短程和中程放疗者[(31.3％,5/16)和(27.3％,15/55)](P＜0.01)。多因素回归分析显示：放疗方案、P53及MRP4蛋白表达均是影响直肠癌放疗敏感性的独立因素(P＜0.05)。结论 MRP4可作为直肠癌术前放疗敏感性预测的指标之一。     

RNA干扰逆转肝癌多药耐药

目的 研究siRNA对肝癌耐药细胞系HepG2/mrp1中多药耐药相关蛋白基因(multidrug-resistant-associated 1,mrp1)及其蛋白产物MRP1表达的抑制作用和逆转其耐药性的效果.方法 设计合成针对mrp1启动子区域的RNA干扰小片段,转染肝癌耐药细胞HepG2/mrp1.通过RT-PCR和流式细胞仪,在mRNA和蛋白质水平评估RNA干扰对mrp1表达的影响;MTT法检测RNA干扰逆转HepG2/mrp1细胞多药耐药性的变化,按照实验组和亲本组细胞的半数抑制剂量(ICso)评估RNA干扰对细胞耐药倍数的改变.结果 在耐药细胞HepG2/mrp1中,RNA干扰明显抑制了 mrp1 mRNA和蛋白产物MRP1的表达水平,在相同浓度药物作用下实验组细胞耐药性显著下降.结论 我们设计的siRNA对肝癌耐药细胞HepG2/mrp1中的mrp1基因有显著的抑制作用,具有良好的逆转多药耐药性的效果.

Abstract：

Objective To investigate the suppression of mrp1 and MRP1 induced by small interfering RNA and the restoration of sensitivity to chemotherapeutic drugs in the multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell lines HepG2/mrp1. Methods mrp1-targeted small interfering RNA duplexes were designed and composed and introduced into multidrug-resistant hepatocellular carcinoma cell lines HepG2/mrp1. The suppression of mrp1 mRNA and its gene product MRP1 was examined by RT-PCR and flow cytometry (FCM), respectively. MTT assay was performed to measure the reverse effect of small interfering RNA based on the results of ICs0. Results The overexpression of mrp1 mRNA and MRP1 was effectively suppressed by small interfering RNAs. The level of mrp1 mRNA in the transfected HepG2/mrp1 cells was reduced to (86.36±2.76)% and MRP1 to (89.38±3.76)%compared with those of the controls. The resistance to ADR was reversed five-fold, which indicated the restoration of sensitivity to drugs. Conclusion Small interfering RNA can inhibit mrp1 expression effectively and reverse the multidrug resistance mediated by MRP1.     

RNA干扰沉默EZH2基因增强人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞对氟尿嘧啶的敏感性

目的 研究沉默人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞的EZH2基因表达是否影响癌细胞对氟尿嘧啶( fluorouracil,5-Fu)的敏感性.方法 体外培养肝癌多药耐药Bel/Fu细胞;EZH2 siRNA干扰沉默EZH2基因表达;RT-PCR和Western blot检测干扰后EZH2 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞生长抑制率;Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测多药耐药相关蛋白MDR1的表达水平.实验设对照组、5-Fu处理组、EZH2 siRNA处理组、5-Fu和EZH2 siRNA联合处理组.结果 EZH2 siRNA干扰24h后,EZH2 mRNA和蛋白的表达水平明显降低.在联合处理组中,MTF法检测其细胞凋亡抑制率为43.17％±3.81％,明显高于其他3组;流式检测联合处理组细胞凋亡率,其细胞凋亡值为30.4％±1.77％,明显高于其他3组.流式检测联合处理组细胞周期,发现联合组G1期细胞的百分比为69.16％±2.31％,明显高于其他3组,S+G2 +M期细胞的百分比为30.76％±1.29％,明显低于其他3组,细胞周期被阻滞于G1期.检测MDR1在联合组中的表达水平,发现MDR1蛋白的表达水平明显低于其他组别.结论 RNA干扰沉默EZH2基因可以增强Bel/Fu细胞对5-Fu的敏感性,其机制可能与MDR1蛋白表达降低有关.     

人结直肠癌耐药细胞株体外药物敏感性实验

目的 观察人结直肠癌细胞被抗肿瘤药物作用后对不同药物的耐受情况。方法 人结直肠癌LOVO细胞系分别在体外与氟尿嘧啶（5－FU）和阿霉素（ADM）作用,成功诱导LOVO／5－FU和LOVO／ADM两个耐药细胞株,体外细胞毒性实验观察它们对5－FU、丝裂霉素（MMC）、ADM、顺铂（DDP）、氨甲喋呤（MTX）、阿糖胞苷（Arac)等6种药物敏感性。结果 两株细胞对5－FU和ADM均有耐药,耐药指数分别为16．48、23．17,LOVO／5－FU对MMC、ADM及DDP为3．37、2．22、2．70倍耐药,LOVO／ADM对MMC、5－FU及DDP为4．96、11．66、3．70倍的耐药。结论 两株耐药细胞均产生了多药耐药（multidrug resistance,MDR),药物引起的耐药一般是交叉耐药。     

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的 检测小干扰RNA(siRNA)对肝癌耐药细胞株HepG2/阿霉素(ADM)多药耐药相关蛋白基因2(MRP2)及其蛋白产物的抑制作用,观察对多药耐药性的影响.方法 使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株(HepG2/ADM),ADM浓度从0.1～2.0 m/L:设计合成针对MRP2的siRNA小片段,转染HepG2/ADM耐药细胞,24 h后通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果;噻唑蓝(MTT)比色法观察抑制MRP2基因表达后,HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性变化,并计算各药物的半数抑制浓度(IC50).结果 HepG2/ADM对ADM、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0.3204、3.8002、0.2014和0.1221;siRNA明显抑制了HepG2/ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);转染MRP2-siRNA后,HepG2/ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小,分别为0.1023、1.4417、0.0452和0.0268.结论 用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2/ADM细胞对化疗药物的耐药性,MRP2基因与HepG2/ADM肝癌细胞的多药耐药性相关,可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性.     

小干扰RNA逆转人乳腺癌移植瘤多药耐药的在体研究

目的探讨以多药耐药相关蛋白(MRP)为靶标的小干扰RNA(siRNA)抑制相应基因的表达,观察其对裸鼠人乳腺癌移植瘤化疗敏感性的影响。方法将以MRP基因为靶标的siRNA电穿孔转入裸鼠人乳腺癌模型中,用RT-PCR方法和免疫组化法检测乳癌组织MRP mRNA和蛋白的表达水平,并检测乳腺癌组织对抗肿瘤药物的敏感性。结果 RT-PCR显示转染siRNA 24 h后MRP mRNA表达降低,为空白对照组的(63.7±8.9)%,两者差异有统计学意义(P0.05);免疫组化检测显示siR-NA转染移植瘤48 h后,MRP蛋白的表达降低,为空白对照组的(54.3±6.4)%,两者差异有统计学意义(P0.05);经MRPsiRNA转染后,表柔比星的抑瘤率为42.2%,而空白转染组的表柔比星抑瘤率仅为11.9%(P0.05)。结论以MRP基因为靶标的siRNA能抑制裸鼠人乳腺癌移植瘤中MRP mR-NA和MRP蛋白的表达,从而使移植瘤对化疗药物表柔比星的敏感性明显增加,部分逆转了肿瘤的多药耐药性。     

RNA干扰逆转人胃癌细胞多药耐药的研究

目的：研究RNA干扰沉默多药耐药（multidrug resistance,MDR）基因对胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-FU,噻唑蓝（MTT）法检测耐药细胞对5-Fu的敏感性,实时荧光定量PCR（Real-time-PCR）检测MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况。结果：与RNAi-control组和normal组相比,RNAi-MDR1组细胞干扰质粒细胞的IC50明显降低,为2.104±0.242（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为76.8%;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）;凋亡率明显升高至（5.757±0.684）%。结论：应用RNA干扰有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,增强了BGC-823/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础。     

短发夹RNA干扰质粒与粉防己碱对结肠癌耐药细胞多药耐药性的逆转作用

目的 比较短发夹RNA干扰质粒与粉防已碱对结肠癌LoVo/5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药细胞多药耐药性(MDR)的逆转作用.方法 用粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒分别对结肠癌LoVo/5-FU耐药细胞进行处理,实验分为对照组(空白对照)、粉防己碱组和转染组(短发夹RNA干扰质粒).应用MTT法检测细胞对5-FU的敏感性;流式细胞仪检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白的阳性表达率;RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达情况;Western blot检测P-糖蛋白的表达情况.多组间的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验.结果 (1)细胞对5-FU的敏感性:对照组、粉防己碱组、转染组的药物半数抑制浓度( IC50)分别为(7.3±0.3)、(4.4±0.7)、(2.4±0.4) mmol/L,3组比较,差异有统计学意义(F =65.27,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.67,P＜0.05).(2)细胞周期的变化:对照组、粉防己碱组、转染组G1期和S期细胞所占比例分别为38.13％±3.75％、51.36％±2.76％、59.24％±4.31％和20.46％±2.23％、14.32％±1.91％、9.40％±1.65％,3组比较,差异有统计学意义(F =25.23,24.37,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=3.67,4.35,P＜0.05).(3)细胞凋亡情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞凋亡率分别为1.32％±0.47％、3.24％±0.26％、5.88％±0.44％,3组比较,差异有统计学意义(F=99.26,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=11.48,P＜O.05).(4)P-糖蛋白的表达:对照组、粉防己碱组、转染组细胞P-糖蛋白的阳性表达率分别为96.9％±2.3％、61.6％±4.9％、76.6％±3.6％,3组比较,差异有统计学意义(F =67.83,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=6.97,P＜0.05).(5)MDR1 mRNA表达情况:对照组、粉防己碱组、转染组细胞MDR1 mRNA的相对表达量分别为1462±161、570±85、233±81,3组比较,差异有统计学意义(F=90.59,P＜0.05);粉防己碱组与转染组比较,差异有统计学意义(q=5.12,P＜0.05).结论 粉防己碱和靶向MDR1的短发夹RNA干扰质粒均能逆转LoVo/5-FU耐药细胞的MDR,且后者逆转作用更强,逆转机制与抑制P-糖蛋白表达及下调MDR1 mRNA表达有关.     

RNA干扰PP2A-Aα基因表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰PP2A-Aα基因表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响.方法 设计了3条shRNA干扰载体并分别稳定的转染结直肠癌SW480细胞.RT-PCR方法筛选出一组干扰效率最高的转染细胞进行进一步实验.应用MTT法检测干扰后结直肠癌细胞的增殖能力,应用Transwell实验检测干扰后结直肠癌细胞的运动侵袭能力.结果 转染pS-shRNA599干扰载体的SW480细胞PP2A-Aα基因表达明显降低,抑制率达72.8%.应用MTT法检测干扰后结直肠癌细胞的增殖能力明显增强(P<0.01);Transwell实验显示,干扰组细胞的穿膜细胞数明显多于对照组细胞(P<0.01).结论 PP2A-Aα基因表达降低可明显提高结直肠癌SW480细胞的增殖能力与运动侵袭能力,PP2A在结直肠癌细胞中可能扮演着肿瘤抑制剂的角色.     

长链非编码RNA调节细胞周期素D1表达对结直肠癌细胞辐射敏感性的影响

目的筛选影响结直肠癌细胞辐射敏感性的长链非编码RNA（1ncRNA）并探讨其作用机制。方法选取RKO和Lovo结直肠癌细胞株梯度照光后行克隆形成实验。应用单击多靶数学模型计算存活分数SF2值并绘制剂量存活曲线：高通量IncRNA／mRNA芯片筛选在RKO与Lovo、以及2Gv照光前后RKO细胞中表达差异2倍以上的lncRNA基因和蛋白编码基因：采用GeneOntology联合Pathway综合分析阳性表达基因主要作用通路：实时PCR进一步检测验证RKO细胞株照光前后P53、P21、细胞周期素（cyclin）D1表达变化。结果克隆形成实验显示,Lovo细胞株SF2=0．47．RKO细胞株SF2=0．53,Lovo辐射敏感性显著高于RKO（P〈O．05）。高通量lncRNA／mRNA芯片筛选得到阳性表达长链非编码RNA基因268条,蛋白编码基因270条;GeneOntologv联合Pathway综合分析显示：细胞周期相关基因所占比重最大（38．6％）,并有多条lncRNA表达水平与cvclinD1编码基因CCNDl组间表达差异显著相关。RKO与Lovo两株细胞P53和P21相对表达量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,RKO细胞cyclinD1相对表达量明显高于Lovo细胞（P〈0．05）;RKO细胞株经2Gy剂量照射前后,P53和P21相对表达量的差异无统计学意义（P〉0．05）,而cvclinD1表达明显下调（P〈0．05）。结论incRNA可能通过形成转录复合物与CCNDl基因结合,调节cvclinD1蛋白表达进而影响结直肠癌细胞辐射敏感性：且lncRNA对cvclinD1表达的调节不依赖于P53-P21-cyclinD1通路。     

磁控靶向RNA干扰抑制结直肠癌中Myc基因表达的研究

目的观察磁性纳米微粒介导的RNA干扰技术基因转染大肠癌Lovo细胞后对Myc基因的转录及表达的影响。方法用自行制备的葡聚糖磁性纳米微粒（DCIONP）为载体，载附含有Myc基因潜在特异性干扰序列的质粒DNA（pGenesil-1-X1、pGenesil-1-X2）、含对照引物的pGen—esil-1-HK，以及裸质粒pGenesil-1。并以单纯DCIONP、不加药组作为对照组，在外加磁场的作用下，转染体外培养的Lovo细胞。通过rt—PCR及Western blot方法分别检测转染24h后大肠癌细胞内Myc基因的mRNA转录水平及相关蛋白的表达。结果磁性转染pGenesil-1-X2的Lovo细胞，其Myc基因的mRNA转录水平明显降低，相关蛋白的表达亦显著降低。结论磁控靶向RNA干扰技术能够发挥干扰效应，抑制Myc基因mRNA的转录以及相关蛋白的表达。     

胃癌体外药敏试验与多药耐药基因、多药耐药相关蛋白表达的关系

目的 探讨胃癌体外化疗药物敏感试验与胃癌组织中多药耐药基因（MDR1）和多药耐药相关蛋白（MRP）基因表达的关系。方法 收集42例手术切除胃癌标本，采用噻唑蓝（MTT）比色法进行胃癌原代细胞培养体外药物敏感试验，检测其对9种临床常用化疗药物的敏感性，并应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测胃癌组织中MDR1和MRP mRNA表达，分析药敏试验结果与MDR1、MRP mRNA表达的关系。结果42例胃癌组织中MDR1、MRP mRNA表达阳性率分别为38．1％和28．9％。CDDP、ADM和OXA耐药组中，MDR1 mRNA表达阳性率显著高于敏感组；在CDDP和HCPT耐药组中，MRP mRNA表达阳性率显著高于敏感组。结论MDR1和MRP高表达是胃癌对多种化疗药物具有耐药性的标志，结合体外药敏试验，有助于临床筛选有效的化疗药物。     

与放疗抵抗相关的长链非编码RNA在不同放疗敏感性结直肠癌细胞株中的表达

目的 筛选与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的长链非编码RNA（lncRNA）.方法 将HT29、SW480、RKO、Lovo和HCT116等5株结直肠癌细胞梯度照光后行克隆形成实验,通过细胞存活率（SF2值）来检测5株细胞的放疗敏感性差异;利用高通量lncRNA芯片筛选在SW480、RKO和Lovo细胞株中两两比较表达差异均大于2倍的lncRNA,并通过实时定量PCR进一步检测所选lncRNA在5株结直肠癌细胞中的表达差异.结果 5株结直肠癌细胞放疗敏感性由低至高（即SF2值由高至低）依次为HT29 （0.83±0.03）、SW480 （0.69±0.02）、RKO （0.53±0.02）、Lovo （0.47±0.05）和HCT116（0.32±0.03）（P＜0.01）.lncRNA芯片筛选得到5种与结直肠癌细胞放疗敏感性相关的lncRNA基因,其中R05532、NR_015441和NR_033374基因表达水平与细胞放疗抵抗呈正相关（均P＜0.01）,而NR_073156和AA745020基因表达水平与细胞放疗抵抗无明显相关性（均P＞0.05）.结论 R05532、NR_015441和NR_033374三种lncRNA可能成为结直肠癌细胞放疗敏感性的预测分子,其高表达提示放疗抵抗。     

表皮生长因子受体表达及其下游基因突变与结直肠癌细胞放射敏感性的关系

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）表达及其下游基因K-ras、B-rM和PIK3CA突变对结直肠癌细胞放射敏感性的影响。方法对9株人结直肠癌细胞株应用实时定量RT-PCR检测EGFR表达,并检测K-ras、B—raf和PIK3CA基因的突变状态;对各细胞株行梯度剂量射线照射后,行克隆形成实验明确其放射敏感性、行Hoechst33258染色凋亡形态学观察和流式细胞术检查细胞凋亡及细胞周期。结果人结直肠癌细胞株EGFR表达与放疗抵抗呈正相关（r=O．717．P=0．030）,~K3CA突变与放疗敏感性有关（t=2．401,P=0．047）,K—ras和B．raf突变与放疗敏感性无关（均P〉O．05）。放疗敏感细胞株（HCTll6）总凋亡率在低放射剂量（2Gy）时即显著增加,并随放射剂量增加而继续增加（P〈0．05）,而放疗抵抗细胞株（HT29）总凋亡率只有放射剂量较大时（6Gy）才明显增加。G1／G。期HCTll6细胞株比例随放疗剂量增加显著降低（P〈0．05）,而HT29细胞株G1／G。期比例在放疗剂量增加时无明显变化（P〉0．05）。结论EGFR通路中多个位点同时参与了结直肠癌细胞的放疗抵抗或敏感作用,EGFR高表达与放疗抵抗相关,PIK3CA突变与放疗敏感有关,放疗抵抗机制可能与抑制细胞凋亡和增加细胞在G1／Go期停顿相关。     

RNA干扰和洛拉曲克对结直肠癌LOVO细胞胸苷酸合成酶表达及细胞增殖的影响

目的探讨下调胸苷酸合成酶（Ts）基因以及化疗药洛拉曲克对人结直肠癌LOVO细胞胸苷酸合成酶表达水平以及对细胞生长、凋亡的影响。方法构建针对人Ts基因的小分子干扰RNA（siRNA）和阴性对照,转染至LOVO细胞,利用RT—PCR和Westernblot技术观察沉默TS基因后其基因和蛋白表达水平的变化,MTF法检测细胞增殖情况;另联合洛拉曲克作用于LOVO细胞,观察两者对LOVO细胞的TS蛋白表达和细胞生长的影响。结果转染TSsiRNA后,LOVO细胞TSmRNA及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组,细胞增殖速度亦低于对照组（均P〈0．05）。TSsiRNA联合洛拉曲克组细胞IC50值为（1．46±0．25）μm01／L,而阴性对照组和单用洛拉曲克组的IC50值分别为（6．81±0．31）μmol／L和（6．47±0．43）μmol／L。TSsiRNA联合洛拉曲克作用于细胞36h后。细胞凋亡指数为（62．12±0．89）％,高于单用TSsiRNA和洛拉曲克[（21．56±0．67）％和（40．51±0．83）％．均P〈0．05]。结论TSsiRNA可以下调人LOVO细胞中TS基因和蛋白的表达,使细胞生长速度减慢,凋亡增加,并可以增强洛拉曲克的药物敏感性。