纤粘连蛋白-整合素相互作用启动胚泡中基质金属蛋白酶活性

纤粘连蛋白是一种主要的细胞上基质,能够与整合素相互作用,介导胚泡的粘附和扩展,首次发现与纤粘连蛋白共同培养的小鼠胚泡产生基质金属蛋白－２和－９;若无纤粘连蛋白,小鼠胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转号分子,其胚泡不产生基质金属蛋白酶－２和－９;焦点粘着激酶是整合素信号转导通路中的关键信号分子,其反义寡聚脱氧核酸显著抑制纤粘连蛋白诱导的胚泡基质金属蛋白酶活性。结果表明,纤     

焦点黏着激酶对胚泡黏附、扩展和基质金属蛋白酶的调节

细胞外基质-整合素相互作用能显著影响胚泡的黏附、扩展和分化, 并能增强胚泡中尿激酶型纤溶酶原激活因子的表达, 因而是胚泡植入的关键因素之一. 焦点黏着激酶(FAK)是细胞外基质-整合素信号转导通路的基础分子. 研究发现, 胚泡表达FAK, 在扩展的滋养层细胞中呈斑点状分布, 在内细胞团中呈弥散分布. FAK的反义寡聚脱氧核酸(ODN)以剂量依赖方式抑制胚泡中64 kD 基质金属蛋白酶-2的活性. 这两种酶活性随反义ODN浓度升高而急剧减弱. 胚泡黏附和扩展也受到FAK反义ODN的影响. 当反义ODN浓度低于20 μg/mL时, 其对胚泡黏附和扩展的抑制作用具有明显剂量依赖关系, 但浓度达到200 μg/mL 时, 胚泡黏附率和扩展率反而回升至正常水平. 研究结果说明, FAK可能通过胞内信号转导通路影响胚泡黏附、扩展和基质金属蛋白酶-2活性, 从黏附和侵入两方面调节胚泡植入.     

纤维黏连蛋白与白血病抑制因子对小鼠胚泡基质金属蛋白酶基因表达的影响

采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）检测了纤维黏连蛋白（FN）及白血病抑制因子（LIF）对小鼠胚泡基质金属蛋白酶基因（MMPs)表达的影响。将胚泡分别加入以下4种胚泡培养液中培养：第1组用FN铺碟;第2组,无FN铺碟;第3组,无FN铺碟,加入20ng/μL白血病抑制因子（LIF）;第4组,用FN铺碟,加入20ng/μL白血病抑制因子（LIF）,然后分别应用MMP－2,－9的引物对经不同培养液培养,培养时间不同（分别为6,12和24h）的小鼠胚泡总RNA进行RT－PCR检测、电泳分析及克隆鉴定。结果显示,第1组培养12和24h的胚泡可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;第3组培养24h的胚泡可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;第4组,培养6,12和24h的胚泡均可产生MMP－2和MMP－9 mRNA;而第2组培养6,12和24h的胚泡均无MMP－2和MMP－9 mRNA产生。以上结果表明,FN可能通过其整合素受体的信号转导通路,启动MMP－2,MMP－9基因转录mRNA;另外LIF对MMPs mRNA的表达也有一定的促进作用,它们共同协调胚泡的侵入能力和子宫内膜的接受能力,保证植入的准确性。     

基质金属蛋白酶-26(MMP-26)在小鼠胚胎植入过程中的作用

基质金属蛋白酶-26（MMP-26，又称Endometase或基质水解素-2）是MMPs家族的一个新成员，它可在胎盘，子宫以及不同肿瘤细胞系中表达，采用子宫角注射，免疫组化，原位杂交，胚泡与子宫上皮单层培养，免疫印迹，RT-PCR和RNA印迹等多种体内外实验方法研究并报道了MMP-26在小鼠胚胎中的表达以及MMP-26抗体在胚胎植入中的作用，研究表明，MMP-26的mRNA与蛋白在小鼠胚泡中均有强烈的表达，此外，体内研究显示，MMP-26抗体能显著抑制小鼠胚胎的着床；在体外培养体系中，MMP-26抗体可显著抑制小鼠胚泡在子宫上皮单层上的黏附与扩展；同时，MMP-26抗体以剂量依赖关系抑制整合素αV亚基mRNA和蛋白的表达，研究提示，MMP-26可能直接或间接参与滋养层细胞侵入子宫内膜的过程，促使小鼠胚泡成功植入。     

LeY对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体ＡＨ６［特异结合Ｌｅ＾Ｙ寡糖,Ｆｕｃ α１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ－］为工具,采用明胶酶谱法,研究细胞表面的Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原与羊床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ,ＭＭＰｓ）之间的关系,从而进一步确定Ｌｅ＾Ｙ寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节。结果显示,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的     

cGMP参与NO对小鼠胚泡黏附扩展及MMP-2分泌的调节

有报道显示, 一氧化氮(NO)在哺乳动物胚胎植入过程中发挥重要的调节作用. 为探讨其作用机制, 应用胚胎植入的体外模型, 将常规方法获取的胚泡随机培养在含有不同药物处理的培养液中, 在培养12, 24和36 h后分别观察、统计胚泡黏附及扩展的情况, 同时收集培养液, 用明胶酶谱分析其中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的变化, 用半定量RT-PCR分析各组胚泡中MMP-2 mRNA的变化. 结果表明, 500 μmol/L L-单甲基-精氨酸(L-NMMA)单独处理能显著抑制胚泡的黏附、扩展及MMP-2的分泌; 此抑制不仅可被同时加入的100 μmol/L S-亚硝基-乙酰青霉胺(SNAP)逆转; 也可被同时加入的20 μmol/L的8-Br-cGMP逆转. 结果提示, NO能促进体外小鼠胚泡的黏附、扩展及MMP-2的分泌, NO的这些作用是通过cGMP来实现的.     

血管内皮生长因子对小鼠胚胎植入过程中基质金属蛋白酶的影响

血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞的特异性致裂原，在血管发生和血管生成过程中占有重要地位，近年来发现，VEGF对胚胎植入也具有一定作用。但有关VEGF与植入中标记分子MMPs之间的关系，迄今未见报道，因此，研究目的是阐明VEGF在小鼠胚胎植入过程中对MMPs的影响，半定量RT-PCR的结果表明，VEGF抗体可显著抑制小鼠子宫MMP-2和-9mRNA的表达；将小鼠胚泡培养于FN铺碟的培养液中，同时用不同浓度的VEGF抗体孵育胚泡，通过明胶酶谱分析检测发现，0.1和1μg/mL的VEGF抗体能明显降低胚泡分泌的MMP-2和-9水解明胶活性的能力，以上结果提示，VEGF抗体可干扰子宫内膜或胚泡MMP-2和-9的基因表达和蛋白分泌，使滋养层细胞向子宫内膜的侵入能力或者子宫内膜接受胚泡的能力降低，影响胚胎植入过程。     

基质金属蛋白酶的催化亚基

近几年来，分子生物学的迅速发展新药研究提供了理论基础，本以对基质金属蛋白酶催化业基的研究为例，说明将分子生物学应用地药物研究的一条途径，基质金属蛋白酶是一类参与结缔组织更新的蛋白水解酶与关节炎、肿瘤扩散转移，牙周炎等疾病有关，一些人的基质金属蛋白酶的催化亚基成功地在大肠杆菌中表达出现，用于用酶抑制剂的随机筛选、酶或酶与抑制复合物的三维结构测定，酶与其抑制剂相互作用的结构活性关系研究，为得到新一代     

Le~Y对小鼠胚泡和子宫上皮细胞分泌MMPs的影响

以单克隆抗体AH6 [特异结合LeY 寡糖 ,Fucα1_2Galβ1_4 (Fucα1_3)GlcNAc_]为工具 ,采用明胶酶谱法 ,研究细胞表面的LeY 寡糖抗原与着床期间小鼠胚泡和单层子宫上皮细胞分泌基质金属蛋白酶 (Matrixmetalloproteinase ,MMPs)之间的关系 ,从而进一步确定LeY 寡糖抗原在着床过程中的具体作用环节 .结果显示 ,不论子宫上皮细胞表面还是胚胎滋养层细胞表面的LeY 寡糖抗原被封闭后 ,都能导致MMPs的分泌减少 ,说明在LeY 寡糖抗原对胚胎着床过程的调节中 ,MMPs起着重要的作用 .认为LeY 寡糖抗原不仅参与胚泡和子宫内膜的识别 ,也通过某种机制调节胚胎着床的侵润过程     

基质金属蛋白酶的催化亚基——分子生物学在药物研究中的应用

近几年来,分子生物学的迅速发展为新药研究提供了理论基础,本文以对基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinases)催化亚基的研究为例,说明将分子生物学应用于药物研究的一条途径。基质金属蛋白酶是一类参与结缔组织更新的蛋白水解酶,与关节炎、肿瘤扩散转移、牙周炎等疾病有关,一些人的基质金属蛋白酶的催化亚基成功地在大肠杆菌中表达出来,用于酶抑制剂的随机筛选、酶或酶与抑制剂复合物的三维结构测定、酶与其抑制剂相互作用的结构活性关系研究,为得到新一代高亲合性、高选择性、高生物利用度的基质金属蛋白酶抑制剂作为药物打下了基础。     

基质金属蛋白酶-28在人细胞滋养层细胞与绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中的表达

细胞滋养层细胞和肿瘤细胞的侵入行为具有惊人的相似性，其中基质金属蛋白酶（MMPs）是滋养层细胞和肿瘤细胞侵入的非常重要的介导因素。近来，MMPs家族的一个新成员－MMP－28被克隆并确定下来，采用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）、酶谱分析和Northern blot等方法，检测了妊娠早期细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系JEG－3细胞中MMP－28的基因表达和蛋白分泌情况。RT－PCR显示，细胞滋养层细胞JEG－3细胞均有MMP－28mRNA的表达；Northern blot研究显示，JEG－3细胞中MMP-28mRNA的表达强于细胞滋养层细胞中MMP－28mRNA的表达，具有时间依赖关系；酶谱分析显示，JEG－3细胞中MMP－228蛋白分泌 活性高于细胞滋养层细胞中MMP－28蛋白分泌活性，呈时间依赖关系，这与MMP－28的基因表达结果相一致。进一步证明了MMP－28可能在正常妊娠和肿瘤发展等一些与组织重建有关的过程中发挥一定的作用。     

焦点粘着激酶在小鼠外胎盘锥体外扩展中的表达、分布和功能

小鼠胚胎植入涉及源于外胎盘锥的洋养层细胞对子宫蜕膜细胞外基质的粘附和侵入，植入时，纤粘连蛋白在蜕膜大量表达并分布在基质细胞周边，其受体在滋养层细胞表达上调。     

基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展中的表达差异分析

研究了基质金属蛋白酶基因MMP20在人食管癌发生发展过程中的表达变化。用RT－PCR检测配对食管癌手术标本及食管癌早期活检组织中MMP20基因表达,用免疫组织化学染色和Western印迹检测表达的MMP20蛋白。发现MMP20基因在mRNA和蛋白质水平上均为食管部过表达,MMP20基因的表达在食管癌发生早期未见明显升高,在浸润癌期明显过高表达,提示在食管癌发展中MMP20过表达与癌细胞浸润相关,是食管癌演进过程中的晚期事件。     

含RGD环六肽与整合素蛋白α_(Ⅱb)β_3的结合反应

ＲＧＤ序列普遍存在于细胞外基质蛋白中,并能为许多整合素蛋白所识别．利用 ＥＬＩＳＡ,ＳＰＲ等技术,对表面固定的人工合成生物素－含 ＲＧＤ环六肽［ｃｙｃｌｏ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－）］与人血小板整合素蛋白α_（Ⅱｂ）β_３的结合能力进行了检测结果表明,含ＲＧＤ环六肽与生物素基团之间的间臂长度在 １．４８～２．２ ｎｍ时, ＲＧＤ序列才能有效进入α_（Ⅱｂ）β_３以头部的反应中心并发生结合反应;反应的平衡解离常数为 １．１μｍｏｌ／Ｌ．为在固体表面研究整合素蛋白介导的细胞吸附过程提供了一个理想的模型系统．     

尖吻蝮蛇毒出血毒素I0.27nm分辨率晶体结构测定

蛇毒含锌金属蛋白酶与基底膜金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有着相似的活性区域和生物学功能,它们同属MMP超家族(MMP superfamily)。MMP超家族蛋白能水解基底膜上的胶原蛋白,对结缔组织细胞分化、基底膜形成和降解起着重要的平衡作用。在人体中,这种子衡的失调常导致关节炎和肿瘤疾病。因此,MMP蛋白成为抗癌症和关节炎药物设计研究中的重要靶蛋白。1994年,两种蛇毒含锌金属蛋白酶:来自东部响尾蛇(eastern diamondback rattlesnake)的Adamalysin Ⅱ和来自西部响尾蛇(western diamondback rattlesnake)的Atrolysin C的晶体结构得到解析。但详细的作用机理,特别是出血作用机理目前尚不清楚。     

基质金属蛋白酶(MMPs)在人滋养层细胞侵入中的作用

基质金属蛋白酶(MMPs)及其天然组织型抑制分子TIMPs是调节许多生理和病理过程中细胞外基质(ECM)有序降解和重塑的重要分子. 胎盘形成(placentation)是妊娠期间的一个重要事件, MMPs/TIMPs系统在调节胎盘中绒毛外细胞滋养层细胞(EVTs)的节制性侵入中发挥重要作用. 本文综述了近些年MMPs/TIMPs家族成员在胎盘中的表达情况及多种因素(物理性因素、激素、细胞因子和生长因子等)通过影响MMPs/TIMPs系统的平衡对滋养层细胞侵入程度的调节. 最后, 对MMPs/TIMPs系统在治疗某些妊娠性疾病如先兆子痫、胎儿宫内生长抑制和绒毛腺癌等的应用前景进行了展望.     

一氧化氮对小鼠胚胎植入的调控

采用子宫角注射及酶谱方法研究了一氧化氮（NO）对小鼠胚胎植入的影响.受试小鼠于妊娠第3天（D3）在一侧子宫角内注射不同剂量一氧化氮合酶（NOS）抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）,另一侧子宫角为对照侧;小鼠于D7颈椎脱臼处死,观察并统计每侧子宫角植入胚胎数.结果发现,与对照侧相比,L-NAME0.05 mg/只处理组胚胎植入数无明显变化（P>0.05）;L-NAME0.2mg/只处理组植入胚胎数显著降低（P<0.05）.在L-NAME中加入NO供体硝普钠（SNP）时,则不影响胚胎植入数（P>0.05）.为进一步探讨NO在胚胎植入中的作用机理,用明胶酶谱方法检测了子官中基质金属蛋白酶-2和-9（MMPs）的活性,结果显示:与对照侧相比,L-NAME 0.2mg/只处理组子宫中 MMP-2的活性没有变化,而 MMP-9活性显著下降;L-NAME与SNP合并应用后,MMP-9的活性恢复正常.结果表明,NO对小鼠胚胎植入起促进作用,这种作用可能是通过影响MMP-9的活性实现的.     

泛素-蛋白水解酶复合体通路对小鼠围植入期子宫血管内皮生长因子及其受体表达的影响

以小鼠宫角注射为动物模型，用0．1μgmL lactacystin抑制子宫中泛素－蛋白水解酶复合体通路，检测小鼠围植入期（妊娠第5－7天）子宫胚胎植入数量变化以及血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（Flt-1和Flk01)的表达变化，结果表明，抑制泛素－蛋白水解酶复合体通路后，小鼠胚胎植入数量显著下降，半定量RT－PCR及Western blot结果显示，注射lactacystin除引起子宫中VEGF及其受体mRAN和蛋白表达显著降低外，也使VEGF转录调节因子HIF－1的α亚基（HIF－1α）mRNA及蛋白表达降低，以上结果表明泛素－蛋白水解酶复合体通路可能通过调节HIF－1α而影响VEGF的表达，同时该通路也参与VEGF受体的表达调控，这可能是影响小鼠胚胎植入的原因之一。     

几个重组蛇毒金属蛋白酶的表达、重折叠及其生物学活性

皖南尖吻蝮蛇毒出血金属蛋白酶acutolysin A除了具有引起动物皮下出血的活性外, 还具有降解纤维蛋白原和纤黏连蛋白的活性. 将acutolysin A以及非出血金属蛋白酶BR的cDNA分别克隆到原核表达载体pET-22b中, 并在大肠杆菌中以包涵体的形式表达了这两个重组蛇毒金属蛋白酶, 即A-22b和BR-22b. 经变性和复性处理后, A-22b具有明显的出血活性, 但没有对纤维蛋白原和纤黏连蛋白的水解活性; 而BR-22b没有出血活性, 却具有降解纤维蛋白原的活性. 此外, 通过PCR方法构建了两个嵌合体基因C1和C2. C1是由BR基因的5′端330 bp和acutolysin A的3′端285 bp构成的嵌合体基因; C2是由acutolysin A基因的5′端324 bp和BR的3′端336 bp构成的嵌合体基因. 将它们克隆进表达载体pET-22b中得到两个表达质粒, 即pC1-22b和pC2-22b. 并以包涵体的形式表达了相应的两个重组蛋白, 即C1-22b和C2-22b. 经同样的变性和复性处理后, C1-22b与BR-22b类似, 具有较强的纤维蛋白原水解活性, 但没有出血活性. 与A-22b相似, C2-22b具有出血活性但没有对这些蛋白的水解活性. 这些结果暗示, 蛇毒金属蛋白酶的N端主亚结构域在出血活性上很可能起关键作用并极大地影响酶对底物的选择性.     

基质金属蛋白酶-2,-9及其组织抑制因子在恒河猴黄体中的表达

基质金属蛋白酶（MMPs)及其组织抑制因子（TIMPs)在黄体形成和退化过程中发挥着重作用。实验目的在于研究MMP家族成员中的明胶酶及TIMPs在恒河猴月经周期新生和退化黄体以及妊娠早期黄体中的表达。收集排卵后第5,15天及妊姑第12,18和26天的卵巢,原位杂交显示,MMP-2mRNA在黄体形成和退化时均有表达,而MMP-9mRNA主要出现在黄体晚期。妊娠时MMP-2,-9mRNA的水平显著降低。妊娠第26天黄体中已检测不到MMP-2mRNA的表达。TIMP-1mRNA在黄体早期和晚期都有较高水平的表达,并持续于早期妊娠的各阶段。TIMP-2mRNA在黄体早期和晚期均表达,随着妊娠时间的进展,其表达呈逐渐增强趋势。在恒河猴黄体中未能检测到TIMP-3mRNA的杂交信号。结果提示,MMP-2,-9和TIMP-1,-2可能在恒河猴黄体功能调控中具有重要作用。MMP-2,-9与TIMP-2可能通过其协同表达而共同参与妊娠早期黄体功能的维持。TIMP-1mRNA稳定的表达模式提示其可能在灵长类黄体中发挥着抑制MMPs以外的其他功能。