人胚胎干细胞体外培养并分化为心肌细胞

目的 :体外培养并鉴定人胚胎干细胞 (EG细胞 ) ,在不添加细胞因子的条件下 ,观察细胞集落分化情况。方法 :取 4～ 6周人胚胎生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴 ,进行组织块培养 ,利用组织化学和免疫组织化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果 :培养 7～ 8小时 ,在组织块周围出现成纤维细胞 ;5～ 7天后 ,在成纤维细胞上出现EG细胞集落 ,集落内细胞表达阶段特异性胚胎表面抗原SSEA 1和SSEA 3,并表达碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;培养 1 8天后 ,有6个集落分化为有节律跳动的心肌细胞 ,这些细胞集落在继续培养 1 5天后 ,仍能有节律收缩。此时集落内细胞ALP表达呈阴性 ,但仍有少量细胞表达SSEA 1和SSEA 3。结论 :体外培养人胚生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴组织块 ,以内源性的成纤维细胞作为饲养层 ,可以分离得到EG细胞集落 ,一些EG细胞集落可以自发地分化成心肌细胞。     

胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

近年来,人们探索如何在体外诱导胚胎干细胞获得配子,以了解性别决定的基因调控和环境影响.这些研究都是用胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）建立1个类原始生殖细胞（primordial germ cell-like cells）的细胞群体,然后移植到睾丸或继续培养从而获得雄性或雌性配子.原始生殖细胞的迁移和向生殖干细胞的分化依赖于自身基因表达以及与周围细胞的相互作用.本文将对原始生殖细胞分化为雄性生殖细胞（有少许为雌性生殖细胞）的关键环节、原始生殖细胞和生殖干细胞分化过程中的标志物做一综述.     

人胚胎生殖干细胞的分离和体外培养

目的：体外培养人胚胎生殖干细胞(EG),在不添加细胞因子的培养条件下,观察细胞生长情况。方法：取5～10周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜,进行组织块培养,采用组织化学及免疫细胞化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果：培养4d后,在成纤维细胞的上面出现EG细胞集落;培养2周后,显示细胞呈圆形,胞质染成深蓝色;细胞染色体均为正常的二倍体核型;碱性磷酸酶活性强阳性;并检测到SSEA-1。结论：体外培养人胚胎生殖腺嵴,利用源于自身胚胎组织的成纤维细胞作为饲养层,可观察到EG细胞集落的形成;培养的细胞初步鉴定为人胚胎干细胞。     

成熟心肌细胞诱导胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞

目的： 拟证实成熟心肌细胞对胚胎干细胞（ESCs）定向分化的诱导作用。方法：分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI（4’6-联眯-2-苯基吲哚）染核作为细胞标记。取昆明小鼠3.5-4 d的囊胚培养后分离出ESCs,以1和（或）2代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞共培养。录像动态观察ESCs向心肌细胞分化的情况;分别于共培养后3、7、14 d对ESCs行肌钙蛋白T（cTnT）免疫荧光染色检测。结果：1代或2代的ESCs和/或细胞团与心肌细胞共培养约7 d左右出现成节律搏动的心肌样细胞;最好实验批次,可计数到1/4以上的ESCs和/或ESCs细胞团出现节律性搏动。心肌细胞共培养体系中添加0.6% DMSO时,节律搏动的心肌样细胞分化率未见提高。心肌细胞诱导组,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;ESCs与心肌成纤维细胞共培养诱导组,分化的细胞cTnT蛋白荧光染阴性;0.6% DMSO诱导组约3％的细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;DMSO联合心肌细胞诱导组,结果与单纯心肌细胞诱导组相似。结论：未经建系操作的ESCs可直接诱导分化为节律搏动的心肌细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞是ESCs定向分化较强的诱导因素。     

叙利亚地鼠原始生殖细胞体外培养方法的初步研究

为建立叙利亚地鼠原始生殖细胞的体外培养方法．在体外无菌分离孕龄10．5d的叙利亚地鼠胚胎的生殖嵴，采用酶机械分离方法获取原始生殖细胞，在条件培养基中培养于饲养层细胞上，然后用酶组织化学染色方法鉴定碱性磷酸酶（ALP）的活性。去除分化抑制因素并诱导原始生殖细胞体外分化后．观察拟胚体和分化细胞的产生。实验结果显示孕龄10．5d的地鼠胚胎生殖嵴．用酶机械分离方法能成功地分离出具有发育多能性的原始生殖细胞，ALP染色鉴定呈强阳性，体外诱导分化后可观察到3种胚层来源的细胞。结果提示该细胞体外培养体系的建立，为生物医学工程学提供了一种新的细胞来源。     

胚胎源性干细胞分化研究的现状

目前，对于胚胎源性干细胞的分化研究已成为当今医学界研究的热点，但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题，近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展。将这三种胚胎源性干细胞从其分化机制及定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述。     

心脏特异的转录因子在胚胎干细胞分化为心肌细胞中的作用

胚胎干细胞在没有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的条件下培养时可以分化成心肌细胞,这些细胞表达一些收缩蛋白,如肌浆球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)和肌球蛋白轻链-2V(ventricular myosin light chain,MLC2V)。很多研究者进一步从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达,结果表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C,MEF2C)和NKx2.5控制着心脏相关基因的表达,它们在心脏发生进程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现多条信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外,纯化胚胎干细胞源性心肌细胞用于治疗心肌梗塞亦是一个关键问题。然而,胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机理还有待进一步研究。     

肝细胞生长因子对鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的作用

目的观察肝细胞生长因子(HGF)在胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化过程中的作用。方法制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(FL),复苏的E14细胞接种在FL上,经直接悬浮法形成拟胚体(EBs),诱导组每孔加2m L胚体完全培养液再加15 ng/m L HGF,对照组只加入胚体完全培养液每孔2ml,免疫荧光染色激光共聚焦扫描显微镜下观察细胞心肌特异性蛋白Mlc-1v的表达,透射电子显微镜下观察分化细胞的超微结构特征。结果制备的FL细胞为长梭型,呈条索状或漩涡状排列,复苏在FL上的ES-E14细胞呈圆形、椭圆形克隆,经悬浮培养后即可见球形悬浮状EBs。诱导分化后第12d的细胞其心肌Mlc-1v蛋白表达阳性,透射电子显微镜下可见细胞核的周围有许多不规则成束的肌丝分布。结论肝细胞生长因子可以促进胚胎干细胞分化为心肌样细胞。     

胚胎源性干细胞分化研究的现状

目前,对于胚胎源性干细胞的分化研究已成为当今医学界研究的热点,但其分化的分子机制和定向分化的方法一直是人们需要解决的难点问题,近年来无论在分子机制研究还是在定向诱导分化研究方面都有了长足进展。将这三种胚胎源性干细胞从其分化机制及定向分化潜能等方面结合国内外研究进展进行综述。     

淫羊藿苷体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞

目的研究淫羊藿苷(icariin,ICA)体外诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)ES-E14细胞分化为心肌细胞的作用。方法复苏的ESCs经直接悬浮法形成拟胚体(EBs),应用ICA定向诱导,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术及Western blot(WB)分别检测心肌细胞特异性肌钙蛋白I(TnI)、心室肌球蛋白轻链(Mlc-1v)的蛋白表达及表达量的变化;透射电镜观察分化细胞的超微结构。结果经ICA诱导后第5天的EBs出现了细胞跳动点,ICA诱导后第3天的细胞心肌细胞特异性肌钙蛋白I(TnI)、心室肌球蛋白轻链(Mlc-1v)的蛋白表达均阳性,于诱导后的第3天(早期)、第12天(中期)及第20天(晚期)心肌细胞特异性肌钙蛋白I(TnI)、心室肌球蛋白轻链(Mlc-1v)的表达逐渐增多,晚期明显高于早期及中期;透射电镜下可见大量平行排列的肌丝。结论用直接悬浮法,ICA体外能诱导鼠ESCs分化为心肌细胞,分化的心肌细胞两种心肌特异性结构蛋白量的表达随分化进程的进展逐渐增多。     

胚体培养对小鼠ES细胞定向神经分化的影响研究

为了研究胚胎干细胞（ES细胞）的定向诱导分化过程中胚体的形成对其后分化的影响，通过悬滴培养、悬浮培养及两者结合的方法得到2～4d的胚体（EBs），利用全反视黄酸（RA）对其处理4d后，进行免疫细胞化学和兴奋性功能的检测，观察比较了不同培养方式和不同培养时间下EBs分化出来的神经细胞所占的比例。结果表明，用单纯悬浮3d或悬滴3d转悬浮1d的培养方法得到的胚体其神经分化的比例较高，这对进一步阐明胚胎干细胞自身内部调控诱导分化的机制有一定的参考意义。     

神经前体细胞不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必经途径

探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的途径,对胰腺组织工程的临床运用有重要意义。将胚胎干细胞在有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层和白血病抑制因子的条件下培养扩增后,再将扩增后的胚胎干细胞不经过神经前体细胞阶段直接诱导为胰岛素分泌细胞,并与传统的多阶段诱导(经过神经前体细胞阶段)进行比较。结果发现,胚胎干细胞脱离饲养层细胞后,经过9~10d的分化诱导,可以分化为具有胰岛β-细胞特征的胰岛素分泌细胞。与传统的多阶段诱导方法相比,诱导过程简化,诱导时间缩短,所得到的胰岛素分泌细胞数量无明显差异。说明胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化存在多条途径。神经前体细胞阶段不是胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的必须途径。用传统的多阶段分化诱导法和直接诱导法都可以将胚胎干细胞诱导成胰岛素分泌细胞。     

Constraints to Progress in Embryonic Stem Cells from Domestic Species

Domestic animal embryonic stem cells are of potentially big value in transgenic research and studies of lineage commitment and development. Unfortunately, despite many efforts, validated embryonic stem cell lines in species other than mice and primates are yet to be isolated. Here we review some factors that might help to explain why derivation of domestic animal embryonic stem cells is still unsuccessful.     

不同胎龄大鼠大脑神经干细胞的分布比较

目的探讨正常状态下不同胎龄大鼠神经干细胞(neural stemeells,NSCs)在大脑中的分布。方法将孕鼠随机分为胎龄11天组、15天组和19天组,用免疫组织化学方法检测其大脑神经干细胞中的巢蛋白(Nestin),经图像分析比较其差异。结果胎龄11天组Nestin阳性细胞分布于整个神经管上皮层,随着胎龄的增加,Nestin阳性细胞主要在室管膜上皮层,细胞数逐渐增加,并向周围迁移;结论大鼠在正常胚胎发育过程中,随着胎龄的增加,其脑室室管膜及室管膜下区神经干细胞逐渐增多。     

Smooth-Muscle-Like Cells Derived from Human Embryonic Stem Cells Support and Augment Cord-Like Structures In Vitro

Engineering vascularized tissue is crucial for its successful implantation, survival, and integration with the host tissue. Vascular smooth muscle cells (v-SMCs) provide physical support to the vasculature and aid in maintaining endothelial viability. In this study, we show an efficient derivation of v-SMCs from human embryonic stem cells (hESCs), and demonstrate their functionality and ability to support the vasculature in vitro. Human ESCs were differentiated in monolayers and supplemented with platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1). Human ESC-derived smooth-muscle-like cells (SMLCs) were found to highly express specific smooth muscle cell (SMC) markers—including α-smooth muscle actin, calponin, SM22, and smooth muscle myosin heavy chain—to produce and secrete fibronectin and collagen, and to contract in response to carbachol. In vitro tubulogenesis assays revealed that these hESC-derived SMLCs interacted with human endothelial progenitor cell (EPCs) to form longer and thicker cord-like structures in vitro. We have demonstrated a simple protocol for the efficient derivation of highly purified SMLCs from hESCs. These in vitro functional SMLCs interacted with EPCs to support and augment capillary-like structures (CLSs), demonstrating the potential of hESCs as a cell source for therapeutic vascular tissue engineering.     

鸡胚生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养

目的　在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方式 ,以获得较多数量与较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。方法　在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼蓝染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果　两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性。结论　提取的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料。     

胶原海绵上诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外实验研究

研究在胶原海绵上间充质干细胞(M SC s)向软骨细胞的定向诱导,以及其对M SC s细胞增殖力、细胞周期的影响,为临床应用胶原海绵作为M SC s支架、修复软骨缺损奠定基础。取大鼠股骨骨髓,经梯度离心法和贴壁法分离M SC s,用加有转化生长因子1β10 ng/m l、地塞米松1-0 7m o l/L、转铁蛋白3 m g/m l、胰岛素2 m g/m l的诱导因子培养基分别在胶原海绵、培养板中进行诱导,14 d后免疫组化检测II型胶原分泌情况,四甲基偶氮唑蓝(M TT)法比较两者之间细胞增殖情况,流式细胞仪(FCM)检测各组细胞周期。14 d后,胶原海绵上及培养板中均诱导出表达II型胶原的软骨细胞,M TT法检测胶原海绵诱导组,和培养板诱导组细胞增殖值分别为0.9213±0.0312和0.5875±0.0258,两者间有显著性差异(P<0.05),FCM检测胶原海绵各组S期 G2/M期百分率,发现其与培养板中同期细胞相比有显著性差异(P<0.05),各组均未发现异倍体。结果表明在胶原海绵上,M SC s能定向诱导为软骨细胞,细胞增值能力更强,M SC s细胞DNA合成、细胞分裂增加,无异倍体产生,可作为一种较为理想的组织工程学支架。     

子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞

目的探讨子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚原始生殖细胞的可能。方法从5—9周人胚胎生殖嵴、中肾嵴、肠系膜中消化分离原始生殖细胞(PGCs),种植于经丝裂霉素c处理的人子宫内膜基质细胞饲养层上培养。结果PGCs可以在体外培养3个多月,传14代。这样培养的PGCs表达胚胎干细胞的多种标志,如碱性磷酸酶染色、SSEA和TRA抗原等。另外细胞保持正常的染色体核型。结论人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞,保持未分化状态。