魁蚶(Scapharca broughtonii)等位基因酶遗传变异研究

采用水平淀粉凝胶电泳技术研究了秦皇岛、大连、青岛和韩国釜山４个魁蚶群体样本的等位基因酶遗传变异。在四个群体的１０～１２种等位基因酶中分别检测到了２２、２６、２２和２７个基因位点,４个群体的多态位点比例（Ｐ０．９９）分别为５０．００、５７．６９、４５．５０和６２．９６％,平均杂合度（观察值）则分别为０．０８７±０．０２４、０．１２３±０．０３８、０．１０５±０．０２３和０．０９１±０．０３１;平均位点有效等位基因数分别是１．２３０、１．３９８、１．４１５和１．２５３。另外,计算４个群体之间的遗传相似度（Ⅰ）和遗传距离（ＤＮｅｉ）,表明遗传同一性以秦皇岛和大连群体之间最大,其次为秦皇岛与青岛及大连与青岛群体之间,韩国釜山与其它３个群体之间存在一定的遗传分岐。４个群体在多个位点上都存在明显的杂合子缺失现象。文中初步探讨了引起杂合子缺失的可能原因     

魁蚶(Scapharca broughtonii)热休克蛋白90(HSP90)基因的克隆及转录表达分析

热休克蛋白90(HSP90)作为一种研究的常规免疫基因,在许多物种都有过报道。本研究从构建的魁蚶转录组文库中筛选得到的HSP90基因部分序列为基础,通过RACE技术获得其c DNA全长序列(命名为Sb HSP90),以期明确魁蚶HSP90基因的结构特征、组织分布及其对病原菌刺激的免疫变化规律。序列和结构分析表明,该c DNA全长2707bp,编码一个由728个氨基酸组成的多肽,该多肽含有HSP90家族共有的5个签名序列,C端高度保守的MEEVD短肽序列和ATPase结构域;预测蛋白的分子量(Mw)为83.72k Da,理论等电点(p I)为4.85;预测该蛋白无信号肽,具有4个糖基化位点。同源性及系统分析表明,Sb HSP90基因与软体动物的HSP90相似性达到83%以上,其中与长牡蛎(Crassostrea gigas)和海湾扇贝(Argopecten irradians)相似度最高达86%,与甲壳动物HSP90的相似度都在81%左右,与脊椎动物HSP90-α和HSP90-β的同源性都很接近。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果表明:Sb HSP90 m RNA在魁蚶血细胞、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌和肝胰腺和中均有表达,斧足中的表达量相对较高,而在肝胰腺中的表达量则相对较低;注射鳗弧菌后,相对于对照组,Sb HSP90基因在所检测的每个组织中m RNA水平上的表达量都显著上调(P0.01),而且具有显著的时间依赖性和瞬时表达趋势。     

4个地理群体魁蚶（Scapharca broughtonii）的形态差异与判别分析

运用多变量形态度量学分析方法对韩国统营、山东黄岛、山东蓬莱、江苏前三岛4 个地理区域的魁蚶（Scapharca broughtonii Schrenck）种群间的形态变异进行了研究。单因素方差分析（ANOVA）和Tukey 检验表明, 魁蚶不同地理种群表现出显著形态变异（P〈0.05）。聚类分析结果表明, 黄岛和前三岛...     

泥蚶(Tegillarca granosa)血红蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表达研究

通过已构建的泥蚶血液cDNA文库,克隆得到泥蚶Tg-HbIIA基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学、组织表达及免疫相关分析。结果表明,泥蚶Tg-HbIIA cDNA全长731bp,包含63bp5′非编码区(5′-UTR),246bp3′非编码区(3′-UTR),开放阅读框450bp,编码150个氨基酸;其氨基酸序列与毛蚶(Scapharca kagoshimensis)和不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)的序列有较高的同源性,分别达到89%和88%;对其结构预测显示该蛋白具有血红蛋白功能域,含有10个潜在血红素结合位点。qRT-PCR检测结果显示:泥蚶不同组织部位中,Tg-HbIIA mRNA在血液表达量最大,其次为外套膜和鳃,表达量最低的是肝胰脏;在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticu)、脂多糖、肽聚糖刺激后,泥蚶血液Tg-HbIIA mRNA表达量显著上调,表明Tg-HbIIA在贝类抗菌免疫防御中可能起重要作用,而Tg-HbIIA对不同致病因子免疫反应的灵敏度和表达时序存在一定差异。     

魁蚶生产性间断升温育苗技术的研究

本文介绍魁蚶间断升温育苗方法，从改善亲贝蓄养条件入手，促使亲贝快速成熟自然产卵，并进行洗卵。在幼虫培育时，加强营养，加大换水，及时筛选不同大小的幼虫分池培养。严格海上中间培育管理，使每立方水体出苗量达31万个（大小0．5cm），取得了明显的经济效益。     

基于SSR标记的魁蚶(Scapharca broughtonii)不同群体遗传结构的分析

运用6对微卫星分子标记分析了山东蓬莱(SP)、山东黄岛(SH)、江苏前三岛(JQ)、韩国统营(Korea)等魁蚶4个地理群体的遗传结构。结果表明,4个魁蚶群体在6个位点的等位基因数(a)为11.3333—14.3333,平均有效等位基因数(ae)为6.2977—9.5873;平均杂合度观察值(Ho)为0.4083—0.5641,平均杂合度期望值(He)0.7849—0.8753,各位点平均多态信息含量(PIC)值为0.7703—0.9102,遗传多样性非常丰富。聚类分析结果表明黄岛群体与前三岛群体聚在一起,蓬莱群体与统营群体聚在一起最后聚类。本研究结果可为今后魁蚶种质资源保护和遗传育种提供遗传学资料。     

儿茶酚胺对魁蚶幼虫变态诱导作用的初步研究

本文研究了L-多巴、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质对魁蚶幼虫的变态诱导作用。结果显示:10-4mol/L的L-多巴有较为显著的诱导能力，而各浓度组多巴胺都不能诱导幼虫变态,且高浓度L-多巴和多巴胺对幼虫有毒害效应。10-4-10-6mol/L的肾上腺素和去甲肾上腺素都能表现出诱导作用并且对幼虫无害,为应用于魁蚶的苗种生产提供了可能。     

魁蚶雌核发育的人工诱导

研究了魁蚶（Scapharca broughtonii）雌核发育的人工诱导条件。用强度为2561uw／（cm2．s）的紫外线（254nm）照射不同时间的精子与正常卵子受精,发现随照射时间的增加,卵裂率、早期胚胎存活率和D形幼虫发生率总体呈下降趋势,遗传失活的精子与正常卵子受精后其胚胎发育至D形幼虫前期停止。经紫外线照射...     

鳗弧菌对魁蚶血细胞形态及免疫功能的影响

本研究采用快速瑞氏-吉姆萨染色法观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后魁蚶(Scapharca broughtonii)几种血细胞的形态变化,研究不同种类血细胞的免疫功能。魁蚶血淋巴液中红细胞、白细胞和血栓细胞经免疫刺激后均发生形态改变,属于免疫防御的应激反应。经鳗弧菌免疫刺激后,红细胞无丝分裂现象增多,并参与病原菌的吞噬作用;白细胞变形运动、吞噬和融合现象普遍,细胞表面具有粘性,参与血栓的形成;血栓细胞主要表现出粘连和凝血的特性,偶有吞噬病原菌的现象;研究中检测了2种常规抗凝剂的抗凝效果,结果表明,2种抗凝剂分别改变了血栓细胞和白细胞的表面粘连特性,从而阻止它们参与凝血,因而都具有抗凝效果。本研究结果表明,魁蚶血细胞分工明确,能共同防御病原菌的入侵,细胞免疫在魁蚶血淋巴液抗菌免疫中起极其重要的作用,血细胞的形态变化和免疫功能分析可为后期研究魁蚶抗菌机制和筛选抗凝剂奠定基础。     

脊尾白虾C-型凝集素基因cDNA全长的克隆和表达分析

本研究利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞c DNA文库中的C-型凝集素基因EST序列,采用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术克隆获得脊尾白虾C-型凝集素基因c DNA全长,命名为Ec CTL。该基因全长1285 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸组成的蛋白质,分子量为38.56 k Da,为甘露糖型凝集素。同源性分析表明,脊尾白虾Ec CTL基因氨基酸序列与秀丽白虾(Palaemon modestus)的同源性最高,达到91%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec CTL基因在血细胞、肝胰腺、肌肉等组织中均有表达,其中在肝胰腺当中的相对表达量最高。感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)后6~12 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec CTL的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究证明脊尾白虾C-型凝集素在其免疫反应中起到重要作用,为进一步探索脊尾白虾免疫系统打下基础。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

魁蚶母源大防御素在子代发育早期的动态变化

母源免疫因子能够通过卵细胞、母乳等方式转移给子代,在免疫系统发育成熟之前发挥重要的免疫保护作用,但贝类中的相关报道较少。为探索贝类非特异性免疫因子在子代发育早期的表达规律,本研究以魁蚶(Scapharca broughtonii)为研究对象,通过qRT-PCR和ELISA分析了大防御素在魁蚶胚胎及幼虫早期发育过程中mRNA和蛋白质的动态变化特征。结果显示,魁蚶卵子受精后发育至壳顶幼虫期,大防御素mRNA和蛋白质的表达变化趋势基本相同,即从受精卵期开始下降,至囊胚期最低,自担轮幼虫期表达量开始上升;与对照组相比,幼虫发育至担轮幼虫期,鳗弧菌(Vibrio anguillarum)处理组的大防御素升高更为显著,mRNA和蛋白的表达水平都基本高于对照组,说明鳗弧菌刺激能够上调担轮幼虫期后魁蚶幼体体内大防御素的表达量。总的来说,研究结果表明魁蚶母源性大防御素能够通过卵子传递给后代,从卵细胞受精后开始被消耗,当幼虫发育至担轮幼虫可能开始自身合成。     

圆斑星鲽(Verasper variegatus)wtl基因的克隆与表达分析

圆斑星鲽（Verasper variegatus）雌鱼生长快,成熟雌鱼个体大小是雄鱼的2倍以上,开展性别相关基因的功能研究,对于探究圆斑星鲽性别决定机制,建立单性培育技术具有重要意义。本研究获得了wt1a及wt1b两个同源基因,wt1a基因全长为3263bp,预测开放阅读框（ORF）长为1245bp,编码415个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长372bp和1640bp;wt1b基因全长为2312bp,预测开放阅读框（ORF）长为1281bp,编码427个氨基酸,5''-UTR和3''-UTR分别长369bp和659bp。wt1a基因编码氨基酸分子量为46.2kDa,理论等电点为9.24,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,编码KTS三肽;wt1b基因编码氨基酸分子量为46.95kDa,理论等电点为8.99,无跨膜结构及信号肽,在ORF末端有4个锌指结构,并且编码KTS三肽。基因表达结果表明：wt1a和wt1b基因主要在圆斑星鲽性腺中表达,精巢的表达高于卵巢,肾脏的表达量显著高于其他组织,推测wt1a基因和wt1b基因在性腺和肾脏发育过程及功能方面均发挥重要作用;在早期发育阶段,wt1a基因在原肠期之前微弱表达,从原肠早期开始逐渐上升至神经胚期表达量达到最高,之后逐渐下降,直至孵化阶段,推测wt1a基因在圆斑星鲽原始生殖细胞分化过程及性腺发育中发挥重要作用。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)白细胞介素8基因的克隆及免疫应答表达分析

由细菌等感染引起的疾病对中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)养殖业的可持续发展造成严重威胁。白细胞介素8 (Interleukin-8, IL-8)在调节炎症反应和抗感染免疫方面扮演着重要的作用。利用PCR扩增和克隆测序获得了中华乌塘鳢IL-8 (命名为BsIL-8) cDNA序列。BsIL-8 cDNA序列全长1 244 bp, 包含576 bp的5’端非编码区序列(5’-UTR), 312 bp的开放阅读框序列(ORF)和356 bp的3’端非编码区序列(3’-UTR)。BsIL-8共编码103个氨基酸, 包含1个由18个氨基酸组成的信号肽和1个由62个氨基酸组成的SCY结构域。其中, SCY结构域包含1个CXC基序(Cys³⁰-Arg³¹-Cys³²)以及4个保守的半胱氨酸残基(Cys³⁰、Cys³²、Cys⁵⁷和Cys⁷³)。序列分析结果表明, BsIL-8与大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)的IL-8序列相似性和一致性最高(分别为92.4%和86.4%)。基因组织表达分布结果显示, BsIL-8基因在主要组织器官中呈泛在性表达, 头肾BsIL-8基础表达量最高, 肝脏次之, 外周血最低。Poly (I:C)免疫刺激后, BsIL-8在4个重要免疫器官(脾脏、肝脏、头肾和外周血)中的表达量均发生了显著的上调(分别在刺激后3、12、24和24 h时表达量达到最高, P<0.01)。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后, BsIL-8基因在脾脏和外周血中的表达量均显著上调(均在感染后12 h时表达量达到最高, P<0.01), 而在肝脏和头肾中的表达量均显著下调(均在感染后12 h时表达量达到最低, P<0.01)。综上所述, BsIL-8基因参与了中华乌塘鳢抗感染免疫应答过程。     

大竹蛏(Solen grandis)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的分子克隆和表达特征分析

本研究克隆得到了一个大竹蛏(Solen grandis)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因(SgTCTP)的cDNA全长,其序列全长为1055bp,5′和3′端的非编码区(UTR)分别为54和461bp,开放阅读框(ORF)540bp,编码179个氨基酸,理论等电点为4.50,预测分子量大小19.96kDa。通过荧光定量PCR法检测了SgTCTP在健康大竹蛏各组织中和病原相关分子模式(PAMPs)刺激后的表达规律,结果表明:SgTCTP在检测组织外套膜、鳃、性腺、血细胞、肌肉和肝胰腺中都有表达,其中在肝胰腺中的表达量最高。脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(β-1,3-glucan)刺激都能诱导SgTCTP的表达量上调,SgTCTP的表达量分别在LPS和PGN刺激后6和3h达到最高,为空白对照的3.64和3.36倍;β-1,3-glucan刺激后SgTCTP的表达量上升幅度最大,在12h达到最高,为空白对照的11.76倍。SgTCTP可能作为急性时相蛋白参与大竹蛏的免疫应答。     

香鱼(Plecoglossus altivelis) JNK1基因克隆及其在成熟卵过熟进程中的表达变化

c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminalkinases,JNKs)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)蛋白超家族成员之一,参与细胞骨架构建、细胞凋亡等多种细胞活动。本研究克隆了香鱼(Plecoglossusaltivelis)JNK1基因cDNA序列,并检测了其成熟卵在排入体腔保存不同时间(0—96h)的过熟过程中JNK1基因的表达变化。结果显示,香鱼JNK1基因cDNA序列全长1670bp,含一个长度1155bp的开放读码框,编码384个氨基酸,预测蛋白分子质量约44.2kDa、理论等电点6.61。氨基酸序列多重比对显示硬骨鱼类中JNK1氨基酸序列高度保守,香鱼与黄鳝的JNK1序列相似性最高(97.6%)。系统进化树分析显示各种脊椎动物的JNK1、JNK2、JNK3分别聚为一簇;本研究获得的香鱼JNK1位于JNK1大簇中并与黄鳝JNK1优先相聚,表明二者进化关系较近。RT-PCR检测结果显示健康香鱼JNK1基因在脑和性腺中高表达,肝和鳃中无表达。实时荧光定量PCR检测显示香鱼成熟卵JNK1基因的表达变化与卵的受精率、孵化率随保存时间延长而降低之间存在相关性:成熟卵随保存时间的延长JNK1表达量逐渐升高、在48h时达到峰值(24h、48h时的表达量分别为0h时的1.49倍和2.55倍),在此期间卵有较高的受精率和孵化率(48h时分别为88.99%和67.32%);保存时间继续延长时卵内JNK1基因都处于高表达水平,72h和96h时的表达量分别为0h时的2.32倍和1.53倍,而卵的质量也在保存超过48h后急剧下降(72h时受精率和孵化率分别为50.2%和25.54%)直至基本失去受精、孵化能力(96h时受精率和孵化率分别为10.83%和0.54%)。综上,香鱼JNK1基因表达上调与香鱼成熟卵的过熟凋亡过程密切相关,为深入研究香鱼JNK1基因的功能及卵过熟机制提供了基础资料。