两种融合蛋白的亲和柱上酶切

对两种融合表达的药物蛋白尝试了固相柱上酶切的方法,即Trx-r-PA、GST-IL-11融合蛋白分别在ETI-SepharoseFF、GST-Agarose亲和柱上酶切,酶切效率均高于液相酶切法.     

幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白高效表达研究

目的高密度培养重组细菌和高效表达重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白。优化细菌培养和重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白表达的发酵工艺条件。重组细菌的培养条件：培养温度为35℃，培养基pH值为7．0～7．5，葡萄糖浓度为0．5％～2．0％，采用合理的策略控制发酵过程代谢副产物乙酸盐浓度不高于4mg/ml,，在BiofloⅢ发酵罐中，3批实验结果表明：重组细菌的平均生物量大约为60g/L发酵液(DCW)，重组幽门螺杆菌尿素酶A融合蛋白平均表达量为35％左右。     

重组融合蛋白Atacicept

Atacicept（TACI—Ig,TACE—Fc5,sTACI）是由默克雪兰诺（Merck Serono）公司开发的一种含有TACI受体胞外BAFF／APRIL结合区域以及人IgG的Fc区域的可溶性重组融合蛋白。在B细胞恶性肿瘤及自身免疫性疾病中,在B细胞激活中起重要作用的肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员——     

结核分枝杆菌重组蛋白和融合蛋白血清学特性比较

目的：比较结核分枝杆菌重组蛋白38 KD、16 KD、EAST6、CFP10和融合蛋白 CFP10-EAST6、38KD-16KD、CFP10-EAST6-38 KD、CFP10-EAST6-16 kD 在结核病血清学诊断中的应用价值。方法利用间接酶联免疫附试验评价确诊结核患者、非结核患者、健康人血清中这4种重组蛋白和4种融合蛋白的抗原性。结果酶联免疫吸附试验结果表明,在确诊结核患者中重组蛋白阳性率最高的是 EAST6为47.3％,特异性最高的是 CFP10和38KD 均为96.6％。融合抗原中阳性率和特异性最高的是 CFP10-EAST6-38 kD 抗原。结论融合抗原 CFP10-EAST6-38 kD 具有很高的阳性率和特异性,可以作为结核病血清学诊断的备选抗原之一。     

肠激酶特点及其基因工程的研究进展

肠激酶是从哺乳动物体内提取的一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于基因T程领域切割融合蛋白。文章对肠激酶的特点及其基因工程研究进展进行了综述。     

重组结核杆菌融合蛋白的临床综合评价

目的 评价重组结核杆菌融合蛋白（EC）的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性,为遴选结核杆菌感染诊断和结核病辅助诊断的皮肤检测药品提供证据。方法 采用系统评价法分析EC与结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）的有效性和安全性;以最小成本分析、成本-效果分析、成本-效用分析评价EC与TB-PPD的短期经济性,采用成本-效用分析评价两者的长期经济性;采用系统评价法、改良德尔菲专家咨询法确定创新性、适宜性和可及性评价的指标,通过各指标的权重计算EC和TB-PPD的各维度的综合评分。结果 EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性评分均高于TB-PPD;两药的可负担性评分一致,EC的可获得性评分低于TB-PPD。考虑维度和指标权重后,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性、可及性评分及其综合评分均高于TB-PPD。结论 相较于TB-PPD,EC的有效性、安全性、经济性、创新性、适宜性和可及性均表现更优;但在可及性维度下,EC的可获得性应进一步改善。     

融合蛋白——一种新的生物工程技术

标记亲和多肽片段以其优越性在基因工程中占有重要的地位,介绍了构建融合蛋白的策略,优点及其存在的不足。     

溴化氰切割融合蛋白条件的研究

目的研究不同因素对溴化氰切割融合蛋白的影响。方法将含有pThioHisA-G13重组质粒的BL21工程菌,经IPTG诱导后,超声破碎,分离并溶解包涵体,再选择不同量的溴化氰、酸浓度及不同溶剂等条件进行溴化氰切割试验,Tricine-SDS-PAGE检测切割效果。结果溴化氰的量,酸浓度及不同溶剂对溴化氰切割包涵体的效果均有影响。结论高效率的切割需要在酸性条件下进行;以尿素作为促溶剂比70%的甲酸更有利于小肽的切割。     

紫外法测定重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白的含量

目的建立紫外法测定重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白(rh EPO-Fc)含量的方法。方法利用Edelhoch法测定rh EPO-Fc的摩尔消光系数,计算得到其溶液百分比消光系数,并测定rh EPO-Fc溶液A280值,依据公式c=A/ε计算rh EPO-Fc的含量。结果 rh EPO-Fc溶液百分比消光系数为1.3,在0.02~1.28 mg/m L浓度范围内,测定含量结果偏差<4%。结论该方法操作简便、专属性强、结果准确可靠,可用于rh EPO-Fc含量测定。     

重组EPO-Fc 融合蛋白对恒河猴的长期毒性和免疫原性研究*

目的:观察重组EPO-Fc对恒河猴的长期毒性和免疫原性。方法:健康恒河猴随机分为EPO-Fc高、中、低剂量组(80,25,8μg.kg-1)和对照组,每组6只,雌雄各半。皮下注射给药,每周1次,连续24周。末次给药后24 h处死2/3,剩下动物停药后继续观察8周。观察症状和检测指标包括:一般情况、血液学、血生化、血电解质、心电图、粪尿、骨髓、病理组织学及血清抗体等各项检测。结果:连续给药后,高、中剂量组的红细胞计数(RBC)、血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB)等升高,这与其药理作用有关。给药第4周高剂量组开始出现抗EPO-Fc抗体,第16周各剂量组大多数动物产生抗体;恢复期间,抗体滴度逐渐降低。其余各项观察指标均未见异常。结论:长期给予EPO-Fc对恒河猴无明显毒性,其安全剂量为80μg.kg-1,但具有免疫原性。     

Fc融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。     

HPLC测定重组Exendin-4-FC融合蛋白注射液中抗氧剂及其降解物

目的 建立HPLC对重组Exendin-4-FC融合蛋白注射液中11种抗氧剂及其降解物含量测定方法。方法 采用饱和硫酸铵沉淀蛋白,离心后上清液转移至经甲醇活化后的C₁₈固相萃取小柱中,分别用4 mL甲醇、5 mL乙酸乙酯依次洗脱小柱,洗脱液用甲醇-乙酸乙酯(2∶3)混合溶剂定容后过0.22μm PTFE疏水滤膜,经HPLC分析,外标法定量。色谱条件：Kinetex^?XB-C₁₈ 100?(100 mm×4.6 mm,2.6μm)色谱柱,检测波长230 nm,柱温箱30℃,进样量5μL,流速0.4 mL·min^–1,流动相0.1%甲酸-甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),运行时间45 min。结果 11种目标物在2.5～35μg·mL^–1内线性关系良好(R²≥0.99)。在25,10,5μg·mL^–1 3个浓度水平下,平均加样回收率为88.1%～106.5%,RSD为0.10%～9.05%。6份样品重复性RSD为2.01%～4.77%...     

Improving the Oral Efficacy of Recombinant Granulocyte Colony-Stimulating Factor and Transferrin Fusion Protein by Spacer Optimization

Purpose To improve the oral efficacy of the recombinant fusion protein containing granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and transferrin (Tf) by inserting a linker between the two protein domains.Materials and Methods Oligonucleotides encoding flexible and helix-forming peptides were inserted to the recombinant plasmids. The fusion protein without linker insertion was used for comparison. The G-CSF cell-proliferation and Tf receptor-binding activities of the fusion proteins were tested in NFS-60 cells and Caco-2 cells, respectively, and in vivo myelopoietic assay with both subcutaneous and oral administration was performed in BDF1 mice.Results All fusion proteins produced from transfected HEK293 cells were positive in Western-blotting assay with anti-G-CSF and anti-Tf antibodies. Among them, the fusion protein with a long helical (H4-2) linker showed the highest activity in NFS-60 cell proliferation assay, with an EC₅₀ about ten-fold lower than that of the non-linker fusion protein. The fusion protein with H4-2 linker also showed a significantly higher myelopoietic effect when administered either subcutaneously or orally in BDF1 mice.Conclusion The insertion of a linker peptide, such as the helix linker H4-2, between G-CSF and Tf domains in the recombinant fusion protein can improve significantly both in vitro and in vivo myelopoietic activity over the non-linker fusion protein.     

PTD-SOD对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护和修复作用研究

目的研究PTD-SOD对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护和修复作用。方法建立Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤模型,采用MTT法检测融合蛋白PTD-SOD对细胞存活率的影响,LDH释放分析检测PTD-SOD对细胞损伤后的保护作用及损伤后细胞内氧化与抗氧化水平的变化。结果对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤,MTT活性检测、LDH分析及氧化与抗氧化水平分析都表明PTD-SOD能明显提高细胞存活率和细胞内抗氧化能力。结论PTD-SOD融合蛋白能保护Na2S2O4诱导缺氧损伤的SH-SY5Y细胞,具有抑制细胞死亡,改善损伤细胞内抗氧化能力。     

液相色谱-串联质谱法研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构

利用液质联用研究重组水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的一级结构。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定水蛭素12肽与瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的相对分子质量；采用液质联用分别分析HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物。MALDI-TOF-MS测得HV12p-rPA的相对分子质量为41 472 Da，与理论值相符；HV12p-rPA的胰蛋白酶(trypsin)酶解产物进行液质联用分析结果表明该融合蛋白中含有瑞替普酶序列；HV12p-rPA的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶解产物进行液质联用分析，结果表明融合蛋白中含有水蛭素12肽，并检测出融合蛋白中的链接肽(DEGGGSY)，融合蛋白的N末端MASDF和C末端LDWIRDNMRP；采用液质联用进行肽图分析，识别出的多肽匹配度Xcorr均超过1.5，部分多肽的Xcorr超过3.0，表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠；目标蛋白的氨基酸序列覆盖率超过85%。结果确定了HV12p-rPA融合蛋白的序列与理论值相符。     

胸腺素α1—硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究

胸腺素α1（thymosin alpha1,Tα1)作为一种免疫增强剂,临床用途广泛。为了大量制备Tα1,按大肠杆菌惯用密码子用人工方法合成Tα1基因,克隆于pUC19的EcoRi和PstI位点,经测序证明序列正确后,串联为4串体（Tα1（4））,经再次确认后克隆入pThioHisA的EcoRI t PstI位点,转化大肠杆菌TOP10菌种,酶切鉴定证明正确后,经1mmol/L IPTG诱导4h,获得硫氧还蛋白与Tα1（4）的融合表达,并经Western blot分析证实,用离子交换柱层可纯化出硫氧还蛋白与Tα1（4）融合蛋白,利用3H－TdR掺入法证实,该融合蛋白具有刺激小鼠脾淋巴细胞的活性。α     

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。     

Discovery of Small Molecule Entry Inhibitors Targeting the Fusion Peptide of SARS-CoV-2 Spike Protein

SARS-CoV-2 entry into host cells relies on the spike (S) protein binding to the human ACE2 receptor. In this study, we investigated the structural dynamics of the viral S protein at the fusion peptide (FP) domain and small molecule binding for therapeutics development. Following comparative modeling analysis and docking studies of our previously identified fusion inhibitor chlorcyclizine, we performed a pharmacophore-based virtual screen and identified two novel chemotypes of entry inhibitors targeting the FP. The compounds were evaluated in the pseudoparticle viral entry assay and SARS-CoV-2 cytopathic effect assay and showed single-digital micromole inhibition against SARS-CoV-2 as well as SARS-CoV-1 and MERS. The characterization of the FP binding site of SARS-CoV-2 S protein provides a promising target for the structure-based development of small molecule entry inhibitors as drug candidates for the treatment of COVID-19.