O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL~(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。     

基于A型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中A型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE 30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组VP3蛋白（rVP3）作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证。将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清,分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测,对比两者检测结果。【结果】成功克隆717 bp的VP3基因,表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白（rVP3）。Western Blot试验结果表明,纯化的 rVP3 蛋白具有良好的反应原性。建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,当样本OD₄₅₀(S)/阳性对照OD₄₅₀（P）＞0.138时判定为SVA抗体阳性。该方法特异性强,与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应;敏感性较好,检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致;重复性和稳定性好,批内变异系数小于4%,批间变异系数小于9%。160份血清检测结果表明,两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异。【结论】建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

1材料与方法1．1材料新生牛血清购自GIBICO生物公司;青霉素、链霉素购自哈尔滨制药六厂;降脂烷购自sigma公司;过碘酸钠购自上海生物试剂公司;脱脂乳购自飞鹤乳业公司;Babl／c小鼠购自兰州生物制品研究所。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原,辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗,经一系列试验,确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1,血清的最佳稀释度为1∶100,血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST,兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明,阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体;与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应;批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%;100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好,可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

口蹄疫病毒O型病毒VP1蛋白表达及鉴定

利用大肠杆菌p ET-30a表达系统表达口蹄疫病毒(FMD)O型野毒株完整的VP1蛋白,并以Western blot试验进行鉴定。结果表明:VP1蛋白以可溶性表达,大小约为25 ku,可与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合。由此说明,口蹄疫病毒VP1原核表达蛋白有良好的反应原性,为构建口蹄疫病毒病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)和快速特异诊断试剂研制奠定基础。     

猪FMDV的VP1结构蛋白特异性抗体间接ELISA的建立

以纯化的FMDV-VP1融合蛋白为抗原,建立了猪口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白间接ELISA检测方法.抗原包被浓度为10μg·mL-1时,血清最佳稀释度为1:40,通过测定30份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准.结果表明,该方法特异性强,重复性好;对216份送检猪血清用EUSA检测,阳性检出率为31.5%,阴性检出率为68.5%,与HA符合率为96.2%,表明建立的VP1结构蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性.     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原,采用过碘酸钠法标记纯化的单抗,建立了单抗竞争ELISA,检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清,试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明,该方法具有稳定和敏感等特性,适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。     

O型口蹄疫病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪O型口蹄疫病毒(FMDV)间接免疫荧光(IFA)检测方法,以猪抗O型口蹄疫病毒阳性血清为一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SPA蛋白(葡萄球菌蛋白A)为二抗,通过反应条件的优化,建立检测方法。结果表明,IFA最佳工作条件为,一抗最适稀释度为1∶50,FITC标记的二抗的最适稀释度为1∶800,最适孵育时间均为1h。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法只能检测O型FMDV,而A型、AsiaⅠFMDV型和猪水疱病病毒(SVDV)检测结果均为阴性。建立的检测O型FMDV抗原的IFA检测方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,可用于FMDV感染的实验室诊断及其在感染机体中的定位和动态分布研究。     

口蹄疫病毒全基因组序列特征分析

对口蹄疫病毒全基因组序列特征的分析有助于了解口蹄疫病毒复制、翻译等生命活动的相关机制.利用DNAStar和DNAMAN软件,对249株口蹄疫病毒全基因组序列进行了比对分析.结果表明,口蹄疫病毒ORF的长度为5 982～7 020 bp,平均长度为6 975 bp,编码1 994～2 340个氨基酸.各基因的核酸序列同源...     

口蹄疫病毒 VP1与3ABC 基因片段的克隆及表达

根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV) VP1和3ABC 基因序列,设计了2对引物. 采用RT-PCR方法从FMDV分离株O/HK/2001扩增得到 VP1和3ABC 基因. 经对它们的核苷酸序列测序和同源性比较,显示与14株O型FMDV参考毒株中的O/HKN/2002同源性最高(分别为98.3%和98.6%),并且在 VP1决定各种亚型FMDV免疫原性的主要抗原决定族的144、148、154和208位     

口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

[目的]探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生,分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法]用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒,通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果]自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加,并且LC3特异的绿色荧光聚集;自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论]Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬,而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达

[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。