低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用

目的：观察低氧预适应（HPC）对氧糖剥夺（OGD）损伤人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的保护作用,并探讨其可能机制。方法：SH-SY5Y细胞随机分为4组：正常对照组：常规培养,不进行OGD处理;HPC处理组：将神经元放入低氧培养箱内（2% O₂）,30 min后立即取出,再恢复常氧培养,反复5次;OGD组：无糖培养基、低氧培养箱内（1% O₂）处理细胞10 h,然后复氧复糖培养24 h;HPC+OGD处理组：细胞HPC后,行OGD处理。通过形态学观察,MTT比色法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）漏出量判断细胞损伤的程度,原位末端标记（TUNEL）法检测凋亡水平,Western blot检测Caspase 3、低氧诱导因子1α（HIF-1α）的蛋白表达。结果：HPC可减轻OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,降低LDH漏出量,明显增加OGD组SH-SY5Y细胞的活力（P<0.05）。Western blot显示HPC+OGD组Cas-pase 3蛋白的表达明显低于OGD组（P<0.05）;HIF-1α蛋白的表达明显高于OGD组（P<0.05）。结论：HPC对体外培养的SH-SY5Y细胞OGD损伤具有保护作用,其机制可能与上调HIF-1α蛋白有关。     

蜗牛多肽混合物对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞PCNA表达的影响

采用H2O2诱导人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)细胞损伤,MTT法测定细胞存活率,不同浓度蜗牛多肽混合物(SPM)处理后,Hoechst染色检测细胞凋亡,细胞免疫化学技术和Western blot技术检测细胞PCNA的表达。结果发现1.54 mmol/L H2O2可诱导SH-SY5Y细胞凋亡,PCNA的表达明显降低。经用39 mg/L(SPM-L组)和156 mg/L(SPM-H组)浓度的SPM处理后,SH-SY5Y细胞凋亡明显减少(H2O2VS.SPM-L:58.39±8.67%VS.44.06±4.35%,P0.05;H2O2VS.SPM-H:58.39±8.67%VS.32.45±9.44%,P0.01),同时PCNA的表达呈浓度依赖性升高。提示SPM可抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与其增加细胞PCNA的表达有关。     

叠氮钠、过氧化氢对SH-SY5Y细胞内硫氧还蛋白还原酶的影响

过度氧化应激是诱发许多神经退变病的重要因素。叠氮钠(NaN3)是线粒体有氧呼吸链细胞色素c氧化酶(COX)的特异性抑制剂,过氧化氢(H2O2)释放氧自由基造成氧化损伤,两者都可以用于氧化应激情况下神经元损伤模型的建立。硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)特异性的还原氧化型的硫氧还蛋白(thioredoxin,TRx),调节细胞中氧化还原的平衡。现以不同浓度NaN3或H2O2,处理人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),建立损伤模型。通过MTT法、形态学方法检测SH-SY5Y细胞损伤程度。同时,通过Western blot定量法、免疫细胞化学法,检测损伤的SH-SY5Y细胞中TR含量的改变,观察TR在胞内的分布。实验表明,NaN3、H2O2,均以浓度依赖方式损伤SH-SY5Y细胞;TR分布于SH-SY5Y细胞的胞浆,表明TR是一种分泌蛋白,损伤后分布无明显变化。但一定浓度的NaN3作用后3h,胞内TR水平显著降低,即神经系统内呼吸链受损可抑制TR的表达,为神经退变病的防治提供了新的思路。     

不同ω-3/ω-6构成比的配伍红花籽油对SH-SY5Y细胞氧化损伤的预防效应

探讨不同ω-3/ω-6构成比的配伍红花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil,CSSO)预防神经细胞氧化损伤的作用。通过过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)氧自由基供体诱导,建立人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化损伤模型;以不同浓度和ω-3/ω-6构成比的CSSO进行细胞药物干预,利用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)和流式细胞仪检测细胞活力变化和细胞凋亡率。我们建立了H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型,其IC50值为1089.54μmol/L H2O2;随着ω-3相对含量递减,CSSO预防细胞氧化损伤的效应增加,且当ω-3/ω-6比例为1∶6.68和有效浓度范围为375～750μg CSSO/mL时,其药物干预组细胞活力(84.1%)显著高于模型组(61.1%),而药物干预组细胞凋亡率(12.6%)明显低于模型组(25.9%)。从以上结果可以推测,CSSO能够保护细胞并预防氧自由基诱导的细胞损伤,其效果可能与CSSO中ω-3/ω-6构成比密切相关。     

CUL1基因对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活和NLRP3炎症体通路的影响

摘要 目的：探究Cullin1（CUL1）基因对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞存活和核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症体通路的影响。方法：（1）将SH-SY5Y细胞分为NC组、NC-sh组、CUL1-sh组、NC-OE组和CUL1-OE组。使用Lipofectamine 2000试剂对细胞转染相应的慢病毒。（2）将SH-SY5Y细胞分为Control组、MPP+组和MPP++CUL1-OE组。MPP+组和MPP++CUL1-OE组细胞使用1 mmol/L的MPP+处理48 h,Control组细胞正常培养。通过MTT法检测细胞增殖,通过Annexin V-FITC/PI双染色法和TUNEL染色法检测细胞凋亡,通过qRT-PCR检测CUL1的mRNA水平,通过Western blot检测CUL1、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、cleaved caspase-1、白细胞介素（IL）-1β和IL-18蛋白水平。通过ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平。结果：（1）与NC组和NC-sh组比较,CUL1-sh组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与NC组和NC-OE组比较,CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。（2）与Control组比较,MPP+组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量降低,相对细胞活力降低,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率升高,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平升高（P<0.05）。与MPP+组比较,MPP++CUL1-OE组CUL1的mRNA和蛋白相对表达量升高,相对细胞活力升高,Annexin V-FITC/PI阳性率和TUNEL阳性率降低,NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平降低（P<0.05）。结论：CUL1可能通过抑制NLRP3炎症体激活促进MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活。     

应用两种方法诱导SH-SY5Y细胞分化的研究

目的：观察全反式维甲酸（ATRA）处理和ATRA与十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）序贯处理（ATRA/TPA）对人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞增殖抑制和形态分化的影响。方法：应用10μM ATRA处理6天和10μM ATRA处理3天继以80 nMTPA处理3天这两种方法使SH-SY5Y细胞分化;用倒置光学显微镜动态观察SH-SY5Y细胞形态学变化;并用MTT比色法比较两种分化方法对SH-SY5Y细胞的体外抗增殖作用。结果：ATRA处理和ATRA与TPA序贯处理对SH-SY5Y细胞都有抗增值和诱导细胞分化作用,细胞形态发生明显的变化,分化成神经元表型,前者主要表现为两端带有长突起的纺锤体样细胞形态,而后者主要是由细胞体延伸出多个突起的多边形的细胞。ATRA分化6天的细胞的存活率下降为78.7%±2.0%。当去除ATRA后,继续培养1天的细胞存活率上升为89%±0.2%,而继续培养2天的细胞存活率为86.3%±1.4%;ATRA与TPA序贯分化6天细胞存活率下降为75.9±0.4%。当去除TPA后,继续培养一天的细胞存活率为75.5±0.7%,继续培养2天的细胞存活率为74.9±1.0%。结论：维甲酸（ATRA）处理和ATRA与十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）序贯处理（ATRA/TPA）均能明显诱导SH-SY5Y细胞分化。这两种分化细胞为神经科学的研究提供了优良的体外培养模型细胞,尤其是ATRA与TPA序贯处理能获得分化完全而稳定的神经元样细胞。     

不同能量的培养条件对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞生长的影响

目的建立热量限制的体外模型,观察不同能量培养条件下对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞生长代谢的影响。方法将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞分别采用含有低浓度（2 g/L）、正常浓度（3.15g/L）或高浓度（4.5 g/L）葡萄糖的培养基进行常规传代培养,利用MTT代谢率、细胞生长曲线及LDH漏出率等指标观察各组细胞生长情况。结果与正常葡萄糖浓度培养条件下培养的对照组相比,高糖组细胞突起缩短,细胞胞体皱缩,MTT代谢率稍低（0.573±0.001）,LDH漏出率高,细胞生长状态差;与对照组相比,低糖组细胞突起伸展,MTT代谢率较低（0.428±0.003）,LDH漏出率低,细胞生长速度缓慢,但是形态良好。结论高糖培养对细胞有损伤作用,细胞代谢加速,更容易衰老死亡;而低糖培养起到保护作用,在热量限制允许范围内降低培养液的含糖量,不但不会对细胞造成损伤,反而对细胞的代谢及生长起到保护作用,延长细胞的总体寿命。     

MAPK磷酸酯酶-1通过抑制JNK和p38的磷酸化调节SH-SY5Y神经母细胞瘤的凋亡

目的研究MKP-1在SH-SY5Y神经母细胞瘤中的抗凋亡。方法建立稳定表达MKP-1的SH-SY5Y细胞,用H2O2诱导细胞凋亡,并通过Western blotting比较分析MKP-1的表达对JNK和p38磷酸化的调节。结果①H2O2诱导SH-SY5Y细胞表达MKP-1,同时导致JNK和p38的去磷酸化;②在稳定表达MKP-1的SH-SY5Y细胞中,MKP-1可以抑制JNK和p38的磷酸化。③稳定表达MKP-1的SH-SY5Y细胞抵抗H2O2诱导细胞凋亡的能力比对照细胞提高了1倍左右。结论MKP-1对神经细胞的凋亡具有重要的调节作用,提示MKP-1作为调节ERK、JNK和p38蛋白激酶信号途径的重要分子,可能对退行性神经系统疾病的发病机制和治疗有重要的作用。     

阿魏酸钠生物学活性——对高糖诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

探讨阿魏酸钠对高糖诱导的人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞凋亡的保护作用及其机制。分别通过葡萄糖培养液,以及具有阶梯阿魏酸钠含量的葡萄糖混合培养液进行SH-SY5Y细胞培养,持续时间为48 h。对其中细胞的存活率使用MTT比色法检测;通过Hoechst33258染色观察细胞核形态改变;细胞凋亡率引入流式细胞仪进行测验;离心获得细胞上清液后,使用对其中含有的8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHd G)组分使用酶联免疫吸附法检测。结果显示阿魏酸钠保护组细胞存活率明显升高,细胞核形态明显改善,组细胞早期凋亡率、上清液中8-OHd G的分泌量均明显降低。结果可见,阿魏酸钠对高糖诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用,其机制可能与阿魏酸钠的抗氧化作用有关。     

低氧诱导因子-1α对SH-SY5Y细胞兴奋性毒性损伤的调节作用

探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在喹啉酸诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤中的作用。将体外培养的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为对照组、喹啉酸低、中、高剂量组及HIF-1α抑制剂二甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)预处理喹啉酸高剂量组,采用噻唑蓝还原法和乳酸脱氢酶漏出率检测法测定细胞损伤程度,Hoechst 33342单荧光染色法观察细胞凋亡,免疫荧光染色法检测HIF-1α在细胞内的表达,免疫印迹法检测细胞HIF-1α、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、Bcl-2和Bax的表达。结果显示,喹啉酸可剂量、时间依赖性地诱导SH-SY5Y细胞损伤,导致细胞凋亡。同时,喹啉酸可使SH-SY5Y细胞HIF-1α表达上调并发生核转位、p-Akt表达增加及Bax/Bcl-2表达比例增加,而2ME2可抑制喹啉酸诱导的SH-SY5Y细胞损伤及降低HIF-1α、p-Akt和Bax/Bcl-2的表达。由此说明,HIF-1α/Akt通路介导了喹啉酸诱导SHSY5Y的细胞凋亡。HIF-1α抑制剂(2ME2)能够减轻喹啉酸致SH-SY5Y细胞损伤程度,减少细胞凋亡。