Effects of Cytokine IL-18 Gene on Antibody Production Induced by Ag85A DNA Vaccine

Objective: To investigate the effects of plasmid containing human IL-18 gene on the humoral immune response of mice immunized by Ag85A DNA vaccines of Mycobacterium tuberculosis H37 Rv strain. Methods: Human IL-18 cDNA was amplified from RNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)by RT-PCR and cloned into the pGEM-TEasy vector.After sequencing IL-18 gene was subcloned into the the sites of BamH I and EooR I digestion of pcDNA3.1. BALB/c mice were injected intramuscularly with eukaryotic expression plasmid pclL18, together with MTB pcAg85A DNA vaccines. The same immunization was repeated three times at intervals of two weeks. Mouse serawere collected at two weeks after the each injection. The titers of anti-Ag85A antibody were detected by ELISA. Results:IL-18 cDNA was amplified successfully from RNA of human PBMCs by RT-PCR and the result of sequencing was correct. The IL-18 gene was correctly inserted into the vector pcDNA3.1, which was confirmed with BamH I and EooR I digestion analysis. The positive plasmid was called pcIL18.After being immtmized with DNA vaccines,the titers of antibody obtained from mice being immtmized by pcAg85A combining with pclL18 were superior to mice inmunized by pcAg85A independently. Conc/us/on: Combination of IL-18 gene with MTB pcAg85A DNA vaccine could observably enhance the humoral immune responses to pcAg85A. It remains further investigated whether IL-18 gene plus MTB pcAg85A DNA vaccine could markedly induce the cellular mediated immune response to Ag85A or not.     

Ag85B-MPT64融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的 研究Ag85B-MPT64(AM)融合基因疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果。方法C57BL／6小鼠63只,随机分为磷酸盐缓冲液(PBS)、空质粒、卡介苗(BCG)、pcDNA／Ag85B、pcDNA／MPT64、pcDNA／Ag85B pcDNA／MPT64、pcDNA／AM组,采用肌肉注射法免疫小鼠,0、3、6周各1次,BCG组只在0周予皮内注射卡介苗1次。末次免疫后第5周用H37Rv经尾静脉注射实施攻击,攻击后6周处死部分小鼠,测血清总IgG,特异性脾淋巴细胞增殖、IFN-γ及IL4分泌水平;观测脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及剩余小鼠的存活时间。结果 AM基因疫苗组诱导的特异性的IgG、脾淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌以及肺、脾组织荷菌量、病理学改变和小鼠存活时间明显优于其他DNA疫苗单独免疫组。结论 AM DNA疫苗在抗结核分枝杆菌感染过程中具有明显的免疫保护作用。     

Ag85A与Ag85B DNA疫苗对膀胱肿瘤免疫效应的实验研究

目的 研究单独及联合应用Ag85A与Ag85B DNA疫苗对膀胱肿瘤的免疫效应.方法 选择6～8周龄雌性Wistar大鼠作为实验对象.以膀胱灌注MNU建立膀胱原位癌模型,左后肢皮下注射BTT739细胞株建立种植性膀胱肿瘤模型.于末次膀胱灌注后14 d随机处死10只大鼠,以确定模型是否成功建立.每种模型均随机分为6组(每组8只):生理盐水(NS)组、pcDNA3.1组(空白质粒组)、pcDNA3.1-Ag85A(Ag85A)组、pcDNA3.1-Ag85B(Ag85B)组、pcDNA3.1-Ag85A+Ag85B组(联用组)、卡介苗(BCG)组,并予相应干预治疗.计算各组肿瘤生长抑制率、荷瘤鼠脾脏T细胞亚群数量变化,检测血清干扰素(IFN)-γ水平,剥离肿瘤进行病理组织学检查.结果 肿瘤生长抑制率:BCG组最高达63.53%,其余依次为联用组53.56%、Ag85B组33.08%、Ag85A组11.50%、空白质粒组1.10%;干预治疗后空白质粒组T细胞亚群无明显变化,其余各组CD4+T细胞与CD8+T细胞亚群的数量及CD4+/CD8+比值均有增加(P＜0.05或P＜0.01);空白质粒组血清IFN-γ平无变化,BCG组升高最明显,其余依次为联用组、Ag85B组、AgB5A组.病理组织学观察显示BCG组、联用组、Ag85B组肿瘤坏死明显,而Ag85A组、NS组和空白质粒组肿瘤坏死不明显.结论 Ag85A与Ag85B DNA疫苗对大鼠原位及种植性膀胱癌有明显的免疫效应,Ag85B DNA疫苗的免疫效力强于Ag85A DNA疫苗;两者联用效果更显著,但不及BCG的抗肿瘤效果.     

结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较

目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 .     

结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫

目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 .     

Ag85A DNA疫苗对肠上皮内淋巴细胞FasL mRNA表达的影响

目的：分析口服Ag85A DNA疫苗对小鼠肠上皮内淋巴细胞（iIEL）FasLmRNA表达的影响.方法：减毒伤寒杆菌运载的Ag85A DNA疫苗经口免疫小鼠,检测iIEL和脾淋巴细胞FasL mRNA的表达.结果：末次免疫后8 d,Ag85A DNA质粒组小鼠iIEL FasL mRNA平均表达水平高于正常对照组和空质粒对照组;空质粒对照组和正常对照组的iIEL FasL mRNA平均表达水平以及3组脾淋巴细胞FasL mRNA的表达水平均未见显著性差异.结论：口服Ag85A DNA疫苗可以上调小鼠iIEL FasLmRNA的表达,而对脾淋巴细胞未见有意义的影响.     

细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定细胞因子GM—CSF和结核杆菌Ag85A融合表达质粒，为研究新型抗结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法：用PCR方法从pc-mGM—CSF质粒中扩增出GM—CSF，构建于pcDNA3．1质粒上，成为pcDNA3．1-GM-CSF。从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌Ag85A基因序列并插入到质粒pcDNA3．1-GM-CSF上，将基因GM-CST的3’端与基因Ag85A的5’端直接连接构建融合表达质粒pcGM85A。结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确。结论：细胞因子GM-CSF和结核杆菌Ag85A融合表达载体构建成功，为研制新型结核病基因疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核杆菌抗原Ag85A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒.经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性.结果:扩增出了约0.9 kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58 000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带.蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别.结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础.     

口服Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达

目的：检测Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道M细胞的表达,探索口服疫苗在肠道局部的摄取方式。方法：将C57BL/6小鼠随机分为2组,即生理盐水组和脂质体包裹重组质粒组。分别将生理盐水和脂质体包裹pCDNA3.1＋/Ag85A以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14 d,末次免疫后14 d处死小鼠,取肠,用免疫荧光方法检测Ag85A在肠道局部M细胞的表达。结果：Ag85A DNA疫苗在小鼠肠道局部M细胞有表达。结论：口服脂质体包裹的DNA疫苗可以被肠道M细胞摄取。     

含结核分枝杆菌Ag85A基因的2型重组腺相关病毒的构建和免疫原性

目的构建含结核分枝杆菌Ag85A基因的2型重组腺相关病毒并初步研究其免疫原性。方法采用PCR法从结核杆菌H37Rv株扩增Ag85A基因,将PCR扩增产物克隆于2型腺相关病毒(AAV-2)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-Ag85A;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到能表达目的基因混合细胞系BHK-Ag85A;用具有rAAV-2包装功能的辅助病毒感染BHK-Ag85A,纯化后得到rAAV-2-Ag85A;Western blotting检测重组病毒Ag85A基因在BHK-21细胞中的表达;rAAV-2-Ag85A免疫Balb/c小鼠,ELISA法检测血清中抗-Ag85A抗体,~(51)Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果PCR扩增的Ag85A基因序列与GenBank公布的序列一致,纯化后得到的rAAV-2-Ag85A滴度为1×10~(12)virus particles/ml;Western blotting检测到rAAV-2-Ag85A在BHK-21细胞中能够表达出一相对分子质量为32000的多肽;rAAV-2-Ag85A免疫的Balb/c小鼠,抗-Ag85A抗体的滴度可达1∶1024,同时还可激发Ag85A特异性的CTL产生。结论rAAV-2-Ag85A构建成功,rAAV-2-Ag85A免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现。rAAV-2-Ag85A对于防止结核分枝杆菌感染,尤其是作为结核病的治疗性疫苗可能具有潜在的应用价值,值得进一步深入研究。     

结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6，Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6，Ag85B和MPT64基因(288bp，978bp and 687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coli Dh5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与献报道一致，证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6，Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。     

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的　为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法　根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果　PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论　成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 ,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础     

分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌抑癌效应的研究

目的 探讨分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应.方法 采用小鼠T739可移植性膀胱癌模型,共80只分为10组,于移植瘤处局部注射分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并用Ag85B蛋白、BCG、IL-2和生理盐水作对照,观察治疗后各组的肿瘤质量、体积和存活期.光镜和电镜下观察肿瘤的形态改变.结果 分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤质量(2.49±0.60) g,非常显著低于Ag85B蛋白组、BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤体积(3.01±0.95) cm3,显著低于Ag85B蛋白组、BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.05,P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠存活天数(35.50±2.60) d,显著长于Ag85B蛋白组,BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.05,P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠的肿瘤质量抑制率为64.50%,肿瘤体积抑制率为62.24%,存活延率为48.66%.光镜下观察Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组肿瘤细胞有明显的炎性细胞浸润、肿瘤细胞坏死、出血等改变;透射电镜下观察,可见细胞膜破裂,细胞器破坏,细胞质固缩,细胞核破坏,核染色质聚集,凋亡小体出现,巨噬细胞吞噬增多等现象.结论 分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长膀胱癌荷瘤鼠的生存期.     

结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。