续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠miRNA表达谱的作用研究

目的通过分析骨质疏松症大鼠模型miRNA表达谱变化,探讨续苓健骨方治疗骨质疏松症的分子机制。方法建立去卵巢法骨质疏松模型大鼠12只,分为模型组6只、续苓健骨方组6只。假手术组6只为对照。造模1个月后,续苓健骨方灌胃12周,检测大鼠胫骨骨密度,检测腰椎miRNA表达谱,对差异表达的miRNAs进行生物信息学分析。结果与假手术组比较,模型组腰椎miRNAs 58条显著下调、97条显著上调;与模型组比较,续苓健骨方组腰椎miRNAs下调的50条显著上调、上调的60条显著下调;与假手术组比较,续苓健骨方组腰椎miRNAs仅8条有差异。生物信息学分析发现,差异miRNAs靶基因主要参与HIF-1、甲状腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、c AMP及MAPK等信号通路。结论建立了续苓健骨方治疗骨质疏松模型大鼠的miRNA表达谱;差异miRNAs可能通过调控HIF-1、甲状腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、c AMP及MAPK等信号通路参与续苓健骨方对骨质疏松大鼠的治疗过程。     

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度及OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的研究续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度的作用及其机制。方法将SD雌性大鼠去卵巢造骨质疏松模型,随机分组:钙尔奇D组、续苓健骨方组和骨质疏松模型组,佐以假手术组对照,给药12周后取材,检测左胫骨骨密度,Elisa方法检测血清骨碱性磷酸酶(BALP)水平,Western blot法测OPG和RANKL蛋白表达。结果(1)续苓健骨方组骨密度均明显高于其它3组,组间比较有统计学意义(与钙尔奇D组P0.05,与假手术组P0.01,与模型组P0.000)。(2)续苓健骨方组BALP水平明显高于模型组,两组比较有统计学意义,P0.01,但与假手术组、钙尔奇D组比较无显著性差异,P0.05。(3)续苓健骨方组OPG蛋白表达水平明显高于模型组,比较有统计学意义,P0.05,RNAKL蛋白表达水平明显低于模型组,比较有统计学意义,P0.01。模型组RANKL蛋白表达明显高于假手术组,P0.05。结论续苓健骨方能显著提高骨质疏松模型大鼠的骨密度,其机制与上调OPG、下调RNAKL蛋白表达有关。     

续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响

目的研究续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度、骨微结构和血液钙磷代谢的影响。方法将40只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓健骨方组[12.71 g/(kg·d)]和碳酸钙组[104.19 mg/(kg·d)],假手术组仅切除卵巢周围脂肪,其余组行双侧卵巢切除术后建立骨质疏松模型。药物干预12周后取材,通过双能X线骨密度仪检测左侧胫骨骨密度,经Masson染色观察右侧胫骨组织显微结构,生化检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、血钙和血磷水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低,骨小梁断裂稀疏、排列不规则,TRAP表达增加,血钙含量降低,血磷含量升高。与模型组相比,续苓健骨方组骨密度增加,骨小梁数量增加、排列较规则,TRAP表达降低,血钙含量升高,血磷含量降低。结论续苓健骨方可提高去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度并改善骨组织微结构,其机制可能与调控血钙磷代谢稳态有关。     

续苓健骨方联合阿仑膦酸钠调控EphB4/EphrinB2双向通路对去卵巢骨质疏松大鼠的研究

目的 观察续苓健骨方联合阿仑膦酸钠对去卵巢快速骨丢失模型大鼠骨密度、结构、骨代谢和EphB4/EphrinB2信号通路的影响,探讨其作用机制。方法 50只雌性SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、续苓健骨方组、阿仑膦酸钠组和联合用药组,行双侧卵巢切除术制备模型;药物分别干预12周后取材,DXA检测股骨骨密度,HE染色观察胫骨组织显微结构,ELISA检测血清Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)水平,Real-time PCR和Western blot检测腰椎EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白的表达水平。结果 与假手术组相比,模型组骨密度显著降低(P＜0.001),骨小梁稀疏并且排列紊乱,S-CTX和PINP含量均增高(P＜0.01),骨组织EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P＜0.001)。与模型组相比,3个药物组骨密度均增高,其中以联合用药组最佳(P＜0.001),骨小梁较密并且排列规则,S-CTX含量不同程度降低,PINP含量不同程度增高,EphB4、EphrinB2 mRNA和蛋白表达水平均增高。结论 续苓健骨方联合阿仑膦酸钠起协同作用,可能通过激活EphB4/EphrinB2信号通路改善骨组织显微结构和血清骨代谢指标,从而提高大鼠骨密度起抗骨质疏松作用。     

续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响

目的探讨续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。方法制备续苓健骨汤含药血清,实验分为空白对照组、含药血清低剂量组、中剂量组和高剂量组。采用CCK-8法和流式细胞术检测续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性测定MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OC、Bmp2、Col1a1mRNA水平。结果与空白对照组比较,中、高剂量续苓健骨汤含药血清能促进MC3T3-E1细胞增殖、S期细胞比率和细胞增殖指数,并且呈现一定的剂量依赖性;同时中高剂量续苓健骨汤含药血清组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性(P0.01)和钙化能力(P0.01),促进Runx2、OC、Bmp2、Col1a1 mRNA的表达(P0.05)。结论续苓健骨汤含药血清能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并通过上调骨形成相关基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表达水平,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的疗效及转录机制研究

探讨续苓健骨颗粒治疗肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症的临床疗效及转录组机制。方法 选取肾虚血瘀型绝经后骨质疏松症患者,随机分为续苓健骨颗粒试验组及骨化三醇对照组。观察两组中医证候积分、骨密度及安全性指标。取6例试验组患者治疗前、后的外周血进行转录组测序,另选6例健康组作为对照,筛选差异表达基因并行KEGG分析。结果 完成病例：试验组27例,对照组27例。试验组中医证候疗效总有效率为96.30 %,显著优于对照组的77.78 %（P?0.05）。治疗后两组中医证候积分、腰脊刺痛、下肢痿软等临床症状评分较治疗前均下降（P<0.05）,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。两组治疗前后骨密度比较差异无统计学意义（P>0.05）,但均保持稳定或呈现上升趋势。两组均未出现严重不良反应。转录组测序：试验组治疗前、后有319个差异基因;试验组治疗前与健康组有598个差异基因,其中19个差异基因（包括FOSB、H4C2、RAMP3等）在治疗后其表达显著改变。KEGG分析结果表明,FOSB参与破骨细胞分化、IL-17信号通路。结论 续苓健骨颗粒治疗绝经后骨质疏松症,能够显著改善临床症状,中医证候疗效优于骨化三醇,其作用机制可能与FOSB、RAMP3、H4C2基因及FOSB参与的破骨细胞分化、IL-17信号通路相关。     

生髓健骨胶囊对酒精性骨质疏松大鼠骨密度、骨矿含量影响的研究

目的从基因分子水平探讨酒精性骨质疏松(alcoholic osteoporosis,AOP)大鼠的发病机制,观察生髓健骨胶囊对AOP大鼠骨密度(bone mineral density,BMD)、骨矿含量(bone mineral content,BMC)表达的影响,探讨生髓健骨胶囊对AOP大鼠模型的中药防治作用机理。方法选取成年雄性(清洁级)SD大鼠120只,称体重,随机分为4组,每组各30只,用白酒灌胃法造模,同时分别给予生理盐水、碳酸钙阿法D3、生髓健骨胶囊灌胃给药。于造模8、12、16周末取材,检测股骨上端BMD、BMC指标。结果检测造模干预8、12、16周后BMD、BMC指标变化,模型组BMD、BMC与正常组比较明显降低,且差异有统计学意义(P0.01),结果表明饮酒大鼠确实存在骨量减少,BMD、BMC降低;中药干预组BMD、BMC与模型组相比显著升高(P0.01);中药干预组BMD、BMC与西药对照组相比,明显升高(P0.05)。结论通过观察生髓健骨胶囊对AOP大鼠的实验指标,证明了生髓健骨胶囊能够提高AOP大鼠骨密度,增加骨矿含量,抑制矿物质丢失,改善大鼠的骨代谢。     

健骨颗粒抗去卵巢大鼠骨质疏松的血清代谢组学研究

目的 运用代谢组学方法从物质代谢角度探讨健骨颗粒治疗绝经后骨质疏松症的机制。 方法 60只大鼠随机分为正常组、模型组和健骨颗粒组，健骨颗粒组给予健骨颗粒药液灌胃，其余组分别给予等量生理盐水灌胃干预。分别于术后6周和12周取股骨、胫骨、腰椎骨进行骨密度及骨生物力学检测，取腹主动脉血进行液相色谱-质谱（LC-MS）检测，综合单变量和多变量统计分析，鉴定并筛选血清代谢物。结果 模型组较正常组骨密度和骨最大载荷显著下降，健骨颗粒组与模型组相比明显恢复，表明造模成功且健骨颗粒组有恢复正常的趋势。模型组血清代谢谱与正常组分离，健骨颗粒组接近正常组。筛选出硬脂酸、皮质酮及泛酸等27个差异代谢物，分别与不饱和脂肪酸、类固醇激素的生物合成及泛酸和辅酶A生物合成等通路有关，涉及脂代谢、核酸代谢及氨基酸代谢等。结论 健骨颗粒可能通过调节多种代谢通路改善绝经后骨质疏松症。     

健骨方治疗膝骨关节炎疗效机制的实验研究

目的通过观察模型组、健骨方组及阳性组对大鼠骨关节炎软骨细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达水平的影响,确定膝骨关节炎的发病及修复机制与p38MAPK介导的细胞信号通路密切相关,通过在信号通路水平干预和调控p38MAPK的表达水平,将有希望成为治疗膝骨关节炎的新的有效途径。方法选用SD大鼠40只,采用Hulth法制备大鼠膝骨关节炎模型,以健骨方灌胃为干预治疗手段,连续喂药3月后处死大鼠,取出患侧关节软骨进行检测。Western blotting测定各组p38 MAPK表达水平。结果 Western blotting显示p38 MAPK磷酸化产物在模型组呈持续表达状态,且明显高于正常组,差异有统计学意义(P0.05);在健骨方呈下降趋势表达状态,给药组与模型组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论通过实验研究p38MAPK信号传导通路与骨关节炎有密切关系,降低其表达水平能够对骨关节炎起到治疗作用;健骨方可影响p38MAPK信号传导通路,此研究阐明了健骨方治疗膝骨关节炎的疗效机制,为临床更加合理有效地治疗膝骨关节炎提供了理论依据。     

补肾固本方对大鼠骨质疏松模型中PI3K/AKT/mTOR信号通路表达的调控研究

目的观察补肾固本方对去卵巢骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨组织中PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响,探讨补肾固本方干预OP的作用机制。方法将100只SD大鼠随机分为5组:正常组(C组)、模型组(M组)、补肾固本方组(B组)、补肾固本方+PI3k受体特异性阻断剂LY294002组(B+L组)、PI3k受体特异性阻断剂LY294002组(L组),除正常组外,其余4组建立去卵巢大鼠OP模型。药物连续干预12周后,采用ELISA方法检测血清中E2、BGP、ALP水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组股骨组织中LC3、Beclin1、caspase-9 mRNA的表达情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组股骨组织中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表达。结果补肾固本方可显著增高OP大鼠血清E2水平,降低BGP、ALP水平,显著上调LC3、Beclin1表达水平,降低caspase-9、PI3K、p-AKT、mTOR的表达;而上述变化能够被PI3k受体特异性阻断剂LY294002所阻断,且其差异具有统计学意义(P0.05)。结论补肾固本方减少去卵巢后大鼠OP的发生,其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路及其下游基因蛋白表达有关。     

胆囊腺瘤-腺癌中的DNA含量和基因表达

目的 研究胆囊腺瘤从增殖到恶变中腺上皮细胞的增殖变化和基因表达。方法 用PCR-RFLP法测定APC、ras基因的表达,ABC免疫化学组织染色法测定p53基因蛋白的表达。用TJTY-300全自动图像分析仪测定胆囊上皮细胞核异型性和DNA含量。结果 (1)胆囊上皮细胞核异型性和DNA含量在胆囊腺瘤-腺癌过程中逐渐增加(P<0.05)。(2)胆囊腺瘤中异倍体比例与腺瘤的大小有明显的关系,直径≥1 cm异倍体比例显著增加(P<0.05)。(3)APC基因和ras基因参与胆囊腺瘤-腺癌过程。p53基因在这一过程中不表达。结论 胆囊腺瘤-腺癌的过程也是胆囊癌发生中一条重要的途径。当胆囊腺瘤直径≥1 cm时具有明显的癌变潜能。其基因表达与胆囊上皮不典型增生一原位癌途径不同,APC、ras基因在表达胆囊腺瘤-腺癌的途径中起主要作用。     

神经母细胞瘤Survivin基因表达和细胞凋亡的研究

目的：探讨神经母细胞瘤（NB）Survivin表达和细胞凋亡。方法：应用免疫组织化学技术和DNA原位末端标记技术检测26例NB中Survivin基因表达和细胞凋亡。结果：NB中15例有Survivin表达阳性细胞检出，阳性检出率57．7％。神经节母细胞瘤（GNB）的阳性检出率为20．0％，NB为66．7％；预后差组织（UFH）组为88．9％，预后好（FH）组这41．2％；I－Ⅱ及ⅣS期为27．3％，Ⅲ－Ⅳ期为80．0％。NB组、UFH组、Ⅲ-Ⅳ期标本Survivin阳性表达率高于GNB、FH、I－Ⅱ及ⅣS期标本，P值分别为0．0823、0．0243、0．0105。17例有凋亡细胞检出NB中12例有Survivin阳性表达，Survivin标记指数与凋亡指数（AI）呈负相关（n=12,γ=-0.591）、与生存时间呈负相关（n=12,γ=-0.629），AI与生存时间则呈正相关（n=16,γ=0.563）。结论：Survivin引起的凋亡抑制与NB发生发展关系密切，是患者预后的重要指标。     

Analysis of gene expression in the tumor-associated macrophage

INTRODUCTION: The tumor-associated macrophage (TAM) is at the front line of the host's defense against malignancy and provides an attractive target for immune-modulatory therapy. However, factors present within the tumor microenvironment can alter macrophage phenotype, preventing its cytotoxic activity and reducing its susceptibility to interferon-gamma and lipopolysaccharide-mediated stimulation. METHODS: Macrophages were isolated from subcutaneous B16 melanoma tumors implanted in C57 BL/6 mice. Wound macrophages were harvested from subcutaneously-implanted PVA sponges, and resting peritoneal macrophages were harvested by peritoneal lavage. Gene expression was analyzed using an Atlas cDNA array (Clontech, Mountain View, CA). RESULTS: TAM demonstrated a pattern of gene expression distinct from both wound and peritoneal macrophage. There is an increase in proliferation-associated genes and in genes encoding the ultrastructural proteins cofillin, zyxin, and vimentin more commonly associated with fibroblast-like cells. In addition, an observed decrease in expression of the CD14 gene, and increase in inhibitory pathways including osteopontin and its receptor CD44, the inositol 1,4,5-triphosphate receptor, and the receptors for interleukin-4 and granulocyte monocyte-colony stimulating factor could explain the resistance of TAM to lipopolysaccharide-mediated stimulation. There was also a significant decrease in the expression of the interferon-gamma second messenger, IRF-1. CONCLUSIONS: This study has identified a number of pathways involved in the suppression of TAM function. Targeting of these pathways may allow for the generation of more effective immune-modulatory anti-neoplastic therapy.     

P53和MDM2基因表达及与膀胱癌生物学行为的关系

目的：研究P53基因和MDM2基因表达及与膀胱癌生物学行为的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测49例膀胱移行细胞癌中P53基因和MDM2基因的表达。结果：P53基因的阳性表达率为51．0％（25／49）,其表达率随膀胱癌的分期、分级升高而升高。MDM2基因的阳性表达率为32．7％（14／49）,其表达率随膀胱癌的分期、分级降低而升高。单有P53基因阳性表达的膀胱癌几乎均为浸润性和中、低分化癌;而当P53基因并MDM2基因表达时,膀胱癌的侵袭性和恶性度明显降低。2年复发组和未复发组的P53基因和MDM2基因的阳性表达率差异均无显著性意义。结论：联合检测P53和MDM2基因表达可更准确地解释和描述膀胱癌的生物学行为。这两种基因表达与膀胱癌预关系值得进一步研究。     

CatSper基因家族在人和小鼠组织中的表达特征

目的研究CatSper基因家族在人和小鼠组织中的分布特点。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与Affymetrix全基因组芯片探针进行杂交,筛选出差异表达基因CatSper基因家族。RT—PCR验证差异表达基因在不同发育阶段的小鼠睾丸组织的表达特征,及其在人和小鼠不同组织中的分布。结果基因芯片分析发现CatSper1、CatSper2和CatSper3在小鼠睾丸的表达呈阶段特异性。RT-PCR结果表明该基因家族在睾丸的表达丰度明显高于其它组织;CatSper1和CatSper4在人体睾丸组织中特异性表达。结论CatSper基因家族在人和小鼠中呈现睾丸特异性表达或高表达,可能在精子发生中发挥重要功能。     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因在结直肠癌组织中的表达

目的 研究儿茶酚胺氧位甲基转移酶(COMT)基因及其编码蛋白在结直肠癌组织和正常结直肠黏膜中的表达情况.方法 留取2009年1月至8月诊治的22例结直肠癌患者的肿瘤组织和正常结直肠黏膜组织,提取标本的总RNA和总蛋白,采用RT-PCR及Western blot方法在基因水平和蛋白水平检测COMT在结直肠癌肿瘤和正常黏膜组织中的表达情况,并应用组织芯片检测COMT蛋白在结直肠癌组织中的表达情况,通过灰度测定比较肿瘤组织与正常组织之间目的基因和蛋白表达水平的差异.结果 在mRNA水平上.结果 肠癌肿瘤组织中COMT基因表达水平的平均光密度值为53 514±15 513,显著高于正常结直肠黏膜组织的4529±1698(P<0.05).Westem blot结果显示可溶性COMT蛋白(S-COMT)在结直肠癌肿瘤组织中表达水平的平均光密度值为54 967±11 919,显著高于正常结直肠黏膜组织的平均光密度值25 962±6713(P<0.05),而膜结合型COMT蛋白(MBCOMT)在两者的表达情况差异无统计学意义.组织芯片检测结果显示COMT蛋白主要定位于细胞质,肿瘤组织中的表达水平在染色强度和阳性率方面显著高于正常结直肠黏膜组织(P<0.05).结论 COMT基因及其编码蛋白在结直肠癌组织中的表达水平显著高于其在正常结直肠黏膜中的表达水平,提示该基因可能在结直肠肿瘤的发生、发展中发挥一定作用.