羊膜和结膜基质诱导胚胎干细胞分化为上皮样细胞的初步研究

目的观察小鼠胚胎干细胞在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。方法36只新西兰兔随机分为3组，每组12只。A组：将表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的小鼠ES-GFP细胞用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后行实验兔结膜下移植；B组：将小鼠ES—GFP细胞接种到人羊膜上共培养4d，用BrdU标记后移植到实验兔结膜缺损区；C组：采用保存羊膜移植到实验兔兔结膜缺损区。分别于移植后1、2、3、4，6和8周，摘取各组实验眼行荧光显微镜、组织学和免疫组织化学检查，荧光检测ES-GFP细胞在组织中的荧光表达，组织学检查移植到结膜基质的ES-GFP细胞的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的ES．GFP细胞CK3／CK12和CK13的表达。结果小鼠ES-GFP细胞接种到人羊膜后能在羊膜上贴附生长，与羊膜共培养4d后部分ES-GFP细胞分化为多角形上皮样细胞，免疫组化显示β1整合素阳性。将负载有ES—GFP细胞的羊膜移植到兔结膜缺损区，术后荧光显微镜可在结膜上皮层检测到绿色荧光带，免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。结论采用保存人羊膜负载小鼠ES细胞行兔结膜移植，小鼠ES细胞能在兔结膜基质存活并增殖。     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

共培养诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的初步研究

目的 探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性.方法 GFP标记的小鼠ES细胞初步分化为EB后,将EB消化为单个细胞,同猪关节软骨细胞按一定比例(1∶3)昆合后接种于PGA材料,体外培养1周后植入裸鼠皮下3周取材.对照组为EB细胞接种组及软骨细胞接种组.取材后行连续冰冻切片,切片分别做荧光拍照,HE染色及甲苯胺蓝染色.结果 组织学结果显示,EB细胞接种组形成畸胎瘤;软骨细胞对照组形成软骨组织;实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体.甲苯胺蓝染色结果和荧光照片对照结果显示,部分软骨组织GFP阳性,由小鼠ES细胞分化而来.结论 软骨共培养体系可以诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化,但得到的软骨组织不纯,混有畸胎瘤组织.     

生长分化因子5诱导兔脂肪干细胞成软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导脂肪干细胞(adipose-deftved stern cells,ADSCs)成软骨细胞分化的可能性及效果. 方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔6只,雌雄不限,体重2～3 kg.取兔皮下脂肪4～6 Ml,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验.波形蛋白免疫组织化学和CD44、CD49d、CDl06免疫荧光染色鉴定ADSCs.调整细胞密度为1×106个/Ml,分别用普通细胞培养液以及含0、10、100 ng/Ml GDF.5的软骨细胞诱导液诱导培养.倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖Mrna的表达;免疫组织化学、阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色和Western blot法检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖表达. 结果 ADSCs呈小圆形、梭形、多角形分布,表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106和波形蛋白呈阴性表达.100 ng/Ml GDF-5诱导的ADSCs呈圆形或类圆形,且细胞增殖旺盛.普通培养液和0、10、100 ng/Ml GDF.5成软骨细胞诱导培养后7 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna表达均呈浓度依赖性增加,除0、10 ng/Ml GDF-5两组间差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组差异均有统计学意义(P<0.05):100 ng/Ml GDF.5诱导培养14 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna以及蛋白表达达高峰,阿利新蓝、甲苯胺蓝染色以及Col Ⅱ免疫组织化学染色均呈阳性. 结论 经一定浓度的GDF-5诱导的ADSCs,Col Ⅱ和蛋白多糖表达明显增加,具有软骨细胞的部分生物学功能.     

诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

兔关节软骨细胞聚集培养的生物学性状观察

目的 观察聚集培养软骨细胞生物学性状的变化,为软骨细胞移植建立合适的体外培养方法。方法2001年11月至2004年6月酶消化法分离成年兔关节软骨细胞,分别低密度单层培养和高密度聚集培养,组化及免疫组化法观察细胞表型变化。结果低密度培养时,前3代细胞增殖迅速,但很快去分化,3代以后增殖缓慢,细胞表型大部丢失;聚集培养时,软骨细胞去分化速度减缓;传3代后细胞聚集培养,细胞表型部分恢复。结论聚集培养利于维持软骨细胞表型,原代细胞聚集培养或传代培养后聚集培养是较好的获取大量优良软骨细胞的培养方式。     

两种诱导方法对去分化软骨细胞Ⅱ型胶原的诱导

目的：用两种不同的诱导方法使去分化的永生化软骨细胞第50代重新表达软骨细胞的Ⅱ型胶原标志性表型。方法：利用NA无血清诱导培养法以及离心管聚集体诱导培养法分别诱导培养去分化的永生化人关节软骨细胞第50代，继用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组化染色、Ⅱ型胶原的RT-PCR检测、胶原定量检测该永生化软骨细胞的Ⅱ型胶原表型表达情况。结果：NA无血清诱导培养法和离心管聚集体诱导培养法均能成功诱导去分化永生化人关节软骨细胞的Ⅱ型胶原表达，但二者促进Ⅱ型胶原分泌并无显著差异。结论：去分化永生化人关节软骨细胞可以经不同的诱导方法而重新表达Ⅱ型胶原表型，无血清诱导培养基与离心管聚集体培养法都能使Ⅱ型胶原重新表达。     

骨髓间质干细胞向软骨细胞表型定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的猪骨髓间质干细胞（Bone Marrow Stem Cells,MSCs)在特定培养液作用下向软骨细胞表型转化，探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法 取成年崇明长枫杂交猪髂骨骨髓5ml，在低糖DMEM完全培养液培养2周，传代后以高糖DMEM无血清特定培养液诱导（含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF－β1 10ng/ml)，在相关显微镜和电镜下进行观察，免疫组化检测Ⅱ型胶原分泌，原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果 细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形转变，透视电镜观察见大量扩张粗面内质网、高尔基体、线粒体。诱导培养后第7，14dⅡ型胶原免疫组化阳性，同时原位杂交检测Ⅱ型胶原mRNA表达呈阳性。结论 MSCs在特定培养液诱导下能向软骨细胞表型转化，并能分泌软膏特异性基质，有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源的应用前景。     

脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究

目的 :研究脂肪干细胞的分离及向软骨方向定向诱导的方法。方法 :从成年兔颈后部或腹股沟处脂肪组织取材 ,酶消化法分离、培养脂肪干细胞 ;免疫荧光测定CD3 4 抗原的表达 ;流式细胞仪测定CD3 4 抗原百分比 ;分别用15 %牛血清、少血清 (5 % )及无血清诱导培养基定向软骨细胞方向诱导 ;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果 :从兔脂肪组织中能分离出生长旺盛的干细胞 ,CD3 4 抗原表达阳性 ,表达百分比与骨髓干细胞无明显差异 ;定向诱导后表现出软骨细胞的特性 ,诱导效果无血清诱导培养基效果最好。结论 :从兔脂肪组织中能分离出干细胞 ;生物学特性与骨髓干细胞相似 ;能向软骨细胞方向诱导 ;无血清诱导培养基效果最好。     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜炎症的实验研究

探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell,HAEC)培养液对角膜炎症反应的抑制作用及机制.方法 体外培养及鉴定HAEC和兔角膜上皮细胞,制备HAEC培养液.根据培养兔角膜上皮细胞的培养液成分不同分为无血清改良杜氏培养基(Dulbeccos modified Eagles medium,DMEM)组(DMEM组)、无血清DMEM与HAEC培养液1:1混合组(混合组)、HAEC培养液组(HAEC组).传代的角膜上皮细胞贴壁24 h后,用磷酸盐缓冲液润洗后按分组更换为上述3种培养液培养48 h后收集细胞.应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HAEC培养液中白介素-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)的含量.采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测3组培养液中兔角膜上皮细胞中的白介素(IL)-1β信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的表达,采用八肽胆囊收缩素(cholecystokinin-octapeptide,CCK-8) 法检测3组细胞的增殖情况.结果 HAEC和兔角膜上皮细胞的形态学观察符合上皮细胞特征.HAEC培养液中IL-1Ra的含量为(153.56±0.36)ng/L,无血清DMEM对照中未检出IL-1Ra.3组培养液中,兔角膜上皮细胞的IL-1β mRNA表达由低至高分别为HAEC组、混合组和DMEM组,3组的IL-1β mRNA表达差异均有统计学意义(均为P<0.05).兔角膜上皮细胞分组培养24、48、72 h后,HAEC组的兔角膜上皮细胞吸光值明显高于混合组和DMEM组,DMEM组的兔角膜上皮细胞吸光值在各时间点均低于混合组(均为P<0.05).结论 HAEC可分泌IL-1Ra抑制角膜上皮细胞IL-1β的表达,减少炎症反应及移植排斥作用,并促进角膜上皮细胞增殖.     

The role of host site in bone induction by transplanted xenogenic epithelial cells

Human epithelial tissue culture line cells (K line) were injected into the leg or abdominal wall muscle, or subcutaneously, in cortisone-conditioned rats. Cartilage and/or bone was induced readily in either of the muscular sites, but not subcutaneously.

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Zusammenfassung Zellen aus der Kultur von menschlichem Epithelialgewebe (K-Stamm) wurden Cortisonvorbehandelten Ratten in die Bein- oder Bauchwandmuskulatur oder subcutan injiziert. Die Bildung von Knorpel und/oder Knochen wurde in diesen zwei Muskelgeweben leicht ausgelöst; dies war jedoch an den subcutan behandelten Stellen nicht der Fall.

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Résumé Des cellules épithéliales humaines, obtenues par culture de tissu (de lignée K), sont njectées dans les muscles de la cuisse et de la paroi abdominale ou dans le tissu sous-cutané de rats conditionnés par la cortisone. Du cartilage et/ou de l'os se forment dans le tissu musculaire, mais non dans le tissu sous-cutané.

     

人骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究

目的 研究人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)在体外单层培养条件下诱导分化为软骨细胞的可行性。方法 取志愿者骨髓9例，密度梯度离心获得hMSCs，进行诱导培养。光镜下观察诱导细胞形态学的改变，免疫组化、原位杂交、RT—PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果 经诱导后hMSCs形态由长梭形逐渐向多角形转变，原位杂交、免疫组化等检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达，RT—PCR检测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、X、Ⅺ型胶原、aggrecan等mRNA表达。结论 hMSCs单层诱导培养条件下，能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、aggrecan等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。     

外源性骨髓细胞在体诱导形成毛囊上皮细胞的研究

目的 观察外源性骨髓细胞能否在体诱导形成皮肤的上皮细胞.方法 获取转增强型绿色荧光蛋白基因的C57BL/6J小鼠原代骨髓细胞和野生型C57BL/6J小鼠原代表皮干细胞,植入野生型C57BL/6J小鼠背部创面并打包.分A、B两组各10只,A组每只植入1.0×107个单纯骨髓细胞,B组每只植入混合骨髓细胞、表皮干细胞各1.0×107个.创面痊愈后应用荧光法和免疫组织化学技术检测新生皮肤内EGFP的表达.结果 两组动物3个月后创面痊愈并有完整的毛发生长.A组新生皮肤内未见EGFP的表达;B组所有新生皮肤(100%)均可见EGFP阳性细胞群,多分布在毛囊内.结论 创伤后小鼠毛囊的再生过程中,骨髓细胞-表皮干细胞接触诱导对骨髓来源细胞向毛囊上皮细胞转化至关重要.     

Construction of bilayered tissue-engineered skin with human amniotic mesenchymal cells and human amniotic epithelial cells

Human amniotic mesenchymal cells (hAMCs) and human amniotic epithelial cells (hAECs) have attracted increasing attention in recent years as a possible reserve of stem cells that may be useful for clinical application in regenerative medicine. The object of this study was to establish a new model for reconstruction of bilayered tissue-engineered (TE) skin with hAMCs and hAECs (amniotic cells TE skin, AC-TE skin). We studied these two types of cells and confirmed that they possessed the properties of stem cells. Mesenchymal-epidermal interactions are responsible for organogenesis. On the basis of this mechanism, we modified the constructing methods of traditional TE skin (TE skin with human fibroblasts and keratinocytes) and then established a new bilayered TE skin-AC-TE skin. Histological and immunochemical methods were carried out to assess AC-TE skin. The results showed that AC-TE skin was similar in morphology to human skin which had stratified epidermis and underlying dermis. AC-TE skin expressed proliferative cells marker Ki67 and epithelial stem cells marker K19; moreover, the constructed AC-TE skin could successfully repair full thickness skin defects on athymic mice. Our findings suggest that AC-TE skin is a useful skin equivalent which has good application prospects in regenerative medicine.     

Sternal repair with bone grafts engineered from amniotic mesenchymal stem cells

Purpose

We aimed at determining whether osseous grafts engineered from amniotic mesenchymal stem cells (aMSCs) could be used in postnatal sternal repair.

Methods

Leporine aMSCs were isolated, identified, transfected with green fluorescent protein (GFP), expanded, and seeded onto biodegradable electrospun nanofibrous scaffolds (n = 6). Constructs were dynamically maintained in an osteogenic medium and equally divided into 2 groups with respect to time in vitro as follows: 14.6 or 33.9 weeks. They were then used to repair full-thickness sternal defects spanning 2 to 3 intercostal spaces in allogeneic kits (n = 6). Grafts were submitted to multiple analyses 2 months thereafter.

Results

Chest roentgenograms showed defect closure in all animals, confirmed at necropsy. Graft density as assessed by microcomputed tomographic scans increased significantly in vivo, yet there were no differences in mineralization by extracellular calcium measurements preimplantation and postimplantation. There was a borderline increase in alkaline phosphatase activity in vivo, suggesting ongoing graft remodeling. Histologically, implants contained GFP-positive cells and few mononuclear infiltrates. There were no differences between the 2 construct groups in any comparison.

Conclusions

Engineered osseous grafts derived from amniotic mesenchymal stem cells may become a viable alternative for sternal repair. The amniotic fluid can be a practical cell source for engineered chest wall reconstruction.     

软骨形态发生蛋白1诱导瘢痕成纤维细胞表达软骨表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白1(CDPM1)诱导瘢痕成纤维细胞向软骨细胞分化,探讨其作为烧伤后耳软骨缺损修复的种子细胞的可行性。方法取瘢痕切除术患者的增生性瘢痕组织,提取瘢痕成纤维细胞,CDPM1诱导培养(2%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/mL),设阴性、阳性对照组。Image Plus图像软件观察细胞形态变化;免疫荧光、RT-PCR及Western Blot分析诱导前后的软骨相关Ⅰ、Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan的表达;对第4代细胞行Micromass法培养诱导,HE染色、免疫组织化学染色及Safranine-O染色对诱导结果进行检测。结果诱导后瘢痕成纤维细胞由长梭形向多角形转变,Image Plus软件分析示诱导后细胞长宽比例为(1.48±0.21):1,与诱导前的(7.21±1.54):1相比,差异有统计学意义(P<0.05);与软骨细胞的(1.31±0.13):1相比,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光、RT-PCR、Western Blot结果显示,诱导后瘢痕成纤维表达软骨相关指标Ⅱ型胶原、Sox9、Aggrecan。Micromass诱导后行HE染色显示,诱导后部分细胞出现软骨特征性陷窝结构,免疫组织化学染色显示Ⅱ型胶原阳性染色,Safranine-O染色显示微团块诱导后细胞基质红染。结论瘢痕成纤维细胞在软骨形态发生蛋白1诱导下可以向软骨细胞分化,有望成为烧伤后耳软骨缺损修复的种子细胞。     

人羊膜上皮细胞对大鼠坐骨神经再生影响的实验研究

目的 通过实验研究了解人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,HAECs)对大鼠坐骨神经再生的促进作用.方法 取60只SD大鼠随机分为两组,羊膜细胞组和对照组,各组再分为2周和4周组,每组15只.制作大鼠周围神经损伤再生室模型,HAECs组局部应用培养的HAECs,对照组局部使用等量的生理盐水.术后分别于2周、4周检测神经传导功能和HE染色观察神经纤维形态学变化.结果 术后2周两组的神经电生理及组织学检测比较差异无统计学意义;4周HAECs组的大鼠坐骨神经传导功能明显恢复,HE染色显示术后坐骨神经手术部位出现大量炎性肉芽组织,呈现纤维性修复,吻合口以远HAECs组神经纤维形态结构较对照组完整,神经纤维与髓鞘直径均较对照组大.结论 HAECs移植可加速大鼠坐骨神经损伤后神经传导功能恢复,有助于有髓神经纤维损伤后的轴突与髓鞘的再生修复.