狂犬病无毒疫苗株SRV9G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０￣１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平瑞连续将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒     

狂犬病口服疫苗SRV_9毒株基因序列的生物信息学分析

为了解狂犬病口服疫苗SRV9毒株的基因序列与生物学特性的关系,并就其主要抗原位点与国内外现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,明确其作为口服疫苗株的分子基础,本试验通过RT-PCR方法对狂犬病口服疫苗SRV9毒株的N、P、M、G、L基因分别进行克隆,并分别连接于pMD19-T载体,经酶切、测序鉴定后,用DNAStar软件对全基因序列进行分析,并与11株目前生产用狂犬病疫苗株进行基因序列比对分析和主要抗原位点的比较。狂犬病口服疫苗SRV9毒株N、P、M、G、L基因序列与其他毒株的序列同源性为81.8%~100.0%,由全基因组进化树可知,SRV9毒株与所有疫苗株在同一个大的分支内,均属于基因Ⅰ型,其中狂犬病口服疫苗SRV9毒株与ERA、SAD B19、SAG-2等口服疫苗株的进化距离最近,而与疫苗生产毒株aG、RC-HL之间的进化距离则较远。狂犬病口服疫苗SRV9毒株与各疫苗株的糖蛋白不同结构区的氨基酸同源性分析表明,狂犬病口服疫苗SRV9毒株与SAD B19、SAG-2、ERA口服疫苗株的膜外区、跨膜区和膜内区的同源性最高。狂犬病口服疫苗SRV9毒株的基因组结构和抗原基因位点特征均与目前生产用口服疫苗株相似,这为今后狂犬病口服疫苗的研制和通过分子生物学技术构建基因重组弱毒疫苗株的研究提供了试验依据。     

狂犬病病毒口服疫苗株SRV9基因组全长cDNA的克隆及特性分析

为了解狂犬病病毒口服疫苗株SRV9的基因序列与生物学特性的关系，明确其作为疫苗株的分子基础，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，获得了贯穿全基因组的3个重叠的cDNA片段。将获得的cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体上并进行序列测定，对测序结果进行拼接得到全长cDNA序列(GenBank登录号：AF499686)。SRV9株与亲本株SAD B19全序列比较分析显示，二者同源性为99．8％，SRV9的变异主要发生在糖蛋白的编码区域，共有5个碱基发生改变．在转录酶蛋白编码区出现2个碱基的改变，其他蛋白编码基因均未出现突变；氨基酸比较分析显示，在转录酶蛋白氨基酸序列发生2个改变；糖蛋白成熟肽的第34位、292位、333位和338位氨基酸分别发生了Gly→Glu。Ala→Thr，Arg→Ser，Ile→Val的改变，其中第34位氨基酸位于第1抗原区，第333位和338位氨基酸位于第1抗原区。这些抗原位点的突变可能是引起病毒蚀斑特性改变、毒力降低和免疫原性及安全性提高的重要原因。     

北京1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及分析

本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株(BJ2012ZW株)在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异.试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析.结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9%~99.7%.与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高(99.7%),进化关系近.G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换.BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异.     

狂犬病弱毒SRV9对街毒暴露小鼠的治疗效果

为评估狂犬病弱毒SRV9对狂犬病街毒暴露小鼠的治疗效果,首先将SRV9通过脑内和肌肉接种3周龄ICR小鼠检测其安全性,然后应用狂犬病街毒接种小鼠,随后在暴露后不同时间用SRV9治疗,研究其保护率.结果显示,SRV9对3周龄ICR小鼠安全,在街毒暴露后1、2、3d,SRV9的保护率分别为70％、60％、30％,而相同暴露时间下单剂量灭活疫苗联合免疫球蛋白的保护率分别是30％、20％、10％.对应用SRV9治疗而成活小鼠的中和抗体检测,发现所有小鼠的抗体水平均达到0.5 IU以上,这些数据初步显示活弱毒SRV9具有用于暴露后治疗的潜力.     

利用电穿孔法对狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株病毒的拯救及鉴定

探讨电穿孔转染法对SRV9Ψ区缺失株重组病毒的拯救及鉴定。利用电穿孔细胞转染法,将纯化的Ψ区缺失株pcDNA-NPMG-L全长质粒和pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L辅助表达质粒共转染至BHK-21细胞中,并进行盲传,借助RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western-blot及透射电子显微镜对重组病毒进行鉴定。结果显示,重组病毒能够产生绿色荧光,透射电子显微镜观察可见典型的弹状病毒,对重组毒株与亲本毒株G蛋白进行Western-blot验证,可获得相应目的条带。结果表明,通过电穿孔细胞转染法,能成功拯救出重组病毒SRV9Ψ区缺失株,为病毒的拯救提供新的转染方法,并能有效提高转染效率,为研发新型狂犬病疫苗提供参考。     

狂犬病无毒疫苗株SRV_9G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了狂犬病无毒疫苗株（ＳＲＶ９）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的两个片段，共约７４０个ｂｐ（４５０～１１４４），含有可以诱导中和抗体的两个抗原决定簇和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平端连接将两片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａＩ位点。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与已发表的狂犬病病毒ＳＡＤＢ１９株的相应序列通过计算机进行比较分析。结果证明两者核苷酸序列的同源性为９８．６％，推导氨基酸序列的同源性为９５．９％，主要抗原区内的几个重要氨基酸（如３３３位精氨酸等）发生了变异，糖基化位点也改变。     

应用电镜技术对狂犬病不同毒株的形态学研究

将狂犬病固定毒ＣＴＮ株（中国济南株）、ＣＶＳ株（国际标准攻击毒株）、ＥＲＡ株（兽用疫苗弱毒株）,分别在小鼠脑组织增殖及ＥＲＡ毒株在ＢＨＫ２１传代细胞增殖,通过超薄切片和负染色制备样品,电镜观察。结果发现,在相同鼠脑组织中,ＣＴＮ株病毒粒子比较难查找,而ＣＶＳ株和ＥＲＡ株较易被发现。另外,在不同毒株的脑组织和细胞培养物另还发现了大量的非典型粒子,诸如削了顶的粒子以及锥形、柱形等形态,同时还发现了胞浆包涵体。通过试验,我们认为：⑴典型病毒数量与免疫原性呈正相关。⑵在观察鼠脑细胞中的病毒时,发现有神经髓鞘部位是难以找到病毒粒子的。⑶狂犬病病毒粒子存在于宿主细胞浆内,核内未发现。     

狂犬病病毒野毒株糖蛋白基因序列测定及分析比较

对我国河南某地野鼠体内分离的狂犬病病毒野毒株MRV糖蛋白全基因进行序列测定，与已发表的代表性毒株糖蛋白基因进行核苷酸和推导氨基酸序列的比较分析，结果表明在同一基因型中，MRV和国际标准攻毒株CVS的同源性最高(96．5％)，和中国减毒株CTN的同源性最低(79．8％)；在G基因的四个功能区中，氨基酸同源性最高的是抗原区，同源性最低的是膜内区；MRV的抗原部位和糖基化位点氨基酸均有变异；建立了各毒株的系统进化树。     

野生动物用狂犬病口服疫苗复合免疫佐剂与诱饵的筛选及其对免疫效果的影响

本研究旨在筛选最佳的复合佐剂和口服疫苗诱饵组方,并将筛选出的复合佐剂口服免疫试验小鼠,检测免疫小鼠血清IgG和肠道IgA抗体效价。采用牛肉粉、鸡肉粉、鱼肉粉、奶粉、血粉为主要原料,以细菌脂多糖、氢氧化锌、枸杞多糖、甘露低聚糖为疫苗免疫佐剂,通过正交试验方法将复合免疫佐剂和口服疫苗诱饵与狂犬病SRV₉病毒混匀后口服免疫试验小鼠,并对免疫动物血清IgG抗体效价进行检测。优化的复合佐剂组方是细菌脂多糖100 μg、氢氧化锌0.8 mg、枸杞多糖50 mg、甘露低聚糖10 mg,免疫小鼠血清IgG抗体含量为3.24 mg/L,肠道IgA抗体含量为1.56 ng/mL;在疫苗诱饵的投喂试验中,狼、狐狸、犬、猫对鱼肉味诱饵的采食率最高,其次是血味和奶味诱饵;诱饵与狂犬病SRV₉病毒混匀后口服免疫小鼠28 d后,血清IgG平均值为1.20 U/L。本试验筛选出口服疫苗复合免疫佐剂,经筛选制备的鱼肉味诱饵具备高采食性,适合野生食肉类动物口服疫苗的制备。可增加狂犬病SRV₉病毒的免疫效应,为进一步研发重组减毒狂犬病口服疫苗提供了必要的技术支撑。     

细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株基因组全长cDNA的构建

试验旨在通过反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉疫苗株,为中国农牧区的狂犬病和包虫病的有效防控提供技术手段。本试验参照狂犬病病毒SRV₉株全基因组序列,利用基因合成技术分别合成狂犬病病毒的结构蛋白N、P、L基因,以及N-P-M基因融合片段和狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因与增强型绿色荧光蛋白eGFP融合片段基因,通过载体酶切插入连接方法,依次将狂犬病病毒L基因、N-P-M基因融合片段和G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1（-）表达载体上,构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉全长cDNA。将合成的基因分别构建于pcDNA3.1（-）表达载体,经转化、质粒酶切、基因测序鉴定结果表明,狂犬病病毒N、P、L、N+P+M和G+EgM123+eGFP基因片段长度分别为1 365、1 107、6 471、3 160和3 256 bp;EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段长度为12 465 bp,各基因片段测序结果为100%。本试验成功构建了EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段和狂犬病病毒N、P、L基因的真核表达载体,为通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒及狂犬病和包虫病二联基因重组口服活疫苗的研制提供参考。     

Construction of Full-length cDNA of Recombinant Rabies Virus SRV9 Strain Expressing EgM123 Gene of Echinococcus granulosus

The aim of the experiment was to construct the recombinant rabies virus SRV₉ vaccine strain with EgM123 gene by reverse genetics technology and provide the technical means for effective prevention and control of rabies and hydatidosis in China's agricultural and pastoral areas.In this study,the structural protein N,P and L genes of rabies virus SRV₉ were synthesized using gene synthesis technology,which was based on the complete genome sequence of rabies virus SRV₉ and the fusion fragment of the N-P-M fusion fragment and the rabies G gene,through the carrier of enzyme insertion connection methods,the recombinant rabies virus L gene,N-P-M gene fusion fragment and G+EgM123+eGFP gene fusion fragment were successively recombined on the expression vector pcDNA3.1(-) to construct the full-length cDNA of recombinant rabies virus SRV₉ with EgM123 gene.The synthesized genes were constructed on pcDNA3.1(-) expression vector,and the results of transformation,plasmid digestion and gene sequencing showed that the length of N,P,L,N+P+M and G+EgM123+eGFP gene fragments were 1 365,1 107,6 471,3 160 and 3 256 bp,respectively.The full-length cDNA fragment of EgM123 gene recombinant rabies virus full-length cDNA was 12 465 bp,and the sequencing results of each gene fragment were 100%.In this experiment,the full-length cDNA fragment of recombinant EgM123 rabies and eukaryotic expression vectors of the N,P and L genes of rabies virus were successfully constructed,which could save EgM123 gene recombinant rabies by reverse genetics,it also provided the reference for the development of rabies and hydatid disease combined gene recombinant oral live vaccine.     

鹿狂犬病病毒G基因主要功能区的序列分析

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出了中国鹿狂犬病野毒株（８２０２株）糖蛋白（Ｇ）基因膜外主要功能区的２个片段，共约８００个ｂｐ（３７０～１１７９），含有可以诱导中和抗体的２个抗原决定簇的基因片段和决定毒力及与神经细胞受体结合部位的基因片段。通过平端连接将２个片段克隆到ｐＵＣ１８的ＳｍａⅠ位点，采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。将这一序列与国内外已发表的１１株狂犬病病毒的相应序列输入计算机进行比较分析，结果表明８２０２株主要功能区与上述１１个毒株核苷酸序列的同源性在７３．０％～９６．４％之间，氨基酸序列的同源性在８６．４％～９４．４％之间，８２０２株与中国疫苗株无论是核苷酸序列还是氨基酸序列的同源性均最高，而与中国街毒（ＣＤＸ－１）的核苷酸序列同源性最低，与ＣＶＳ株的氨基酸序列的同源性最低。本研究对于进行狂犬病病毒的分子流行病学调查和研制鹿狂犬病基因工程苗具有重要意义     

基因重排狂犬病病毒疫苗株免疫效果的初步研究

试验探究了基因重排狂犬病病毒(RV)弱毒疫苗株能否刺激小鼠产生RV抗体免疫球蛋白G(IgG),比较了其不同免疫方式、不同免疫剂量对小鼠抗体水平的影响及安全性评估。选取28只体重(20±3)g、35日龄左右的昆明系小白鼠,随机分为7组:第1组为低剂量口服组:复合佐剂50μL+病毒液50μL;第2组为中等剂量口服组:复合佐剂150μL+病毒液150μL;第3组为高剂量口服组:复合佐剂300μL+病毒液300μL;第4组为低剂量注射组:复合佐剂50μL+病毒液50μL;第5组为中等剂量注射组:复合佐剂150μL+病毒液150μL;第6组为高剂量注射组:复合佐剂300μL+病毒液300μL;第7组为口服对照组:复合佐剂300μL+SRV9亲本毒株300μL,分别于0、7、14d进行免疫,采用ELISA定量检测试剂盒对各免疫组小鼠的血清IgG水平进行检测,免疫期结束后取各免疫组小鼠的肝脏、肾脏、肺脏、脑组织制作病理组织切片对疫苗的安全性进行评估。结果显示,各免疫组均产生了RV抗体IgG;肌内注射免疫产生的抗体速度较口服免疫快,但肌内注射免疫会导致小鼠发病死亡;600μL口服免疫组产生的抗体水平显著高于100、300μL口服免疫组及亲本毒株SRV9对照组(P<0.05),说明适当加大口服免疫剂量会使口服免疫组产生的抗体水平增加,并且不会引起不良反应。病理组织学检查发现,各口服免疫组小鼠的肝脏、肾脏、肺脏、脑组织的形态结构较为正常,未发生病变,表明基因重排RV疫苗株口服免疫副作用小、安全性较好。本试验结果为研制新型口服疫苗开辟了新的方向。     

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。