脐血内皮细胞对脐血早期造血细胞的体外扩增作用

目的:观察脐血内皮细胞联合细胞因子组合通过非接触方式对脐血早期造血细胞的扩增作用.方法:采用优化的内皮细胞培养基培养脐血内皮细胞;实验组分为细胞因子组合组(SCF IL-3 IL-6 GM-CSF,CKs组)和脐血内皮细胞联合CKs非接触脐血CD34 细胞培养组(noncontact组).MiniMACS磁珠分选脐血CD34 细胞;检测CKs组与nocontact组培养7d后脐血早期造血细胞的扩增倍数.结果:noncontact组和CKs组都能扩增早期造血细胞, noncontact组对早期造血细胞的扩增倍数显著优于CKs组的扩增倍数.结论:脐血内皮细胞联合CKs非接触培养对脐血早期造血细胞的扩增作用显著优于CKs组.     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

细胞因子参与下的脐血造血干细胞体外扩增

目的观察细胞因子参与下脐血干细胞体外扩增效果。方法用含15%胎牛血清改良细胞培养液,加入不同的细胞因子,设置1个对照组和3个实验组,分别于培养第0d、3d、7d、14d取培养液,台盼蓝染色计数单个核细胞的总数、流式细胞仪分析CD34＋细胞含量。结果与对照组相比,实验组单个核细胞的数量和CD34＋细胞的百分比均有显著增加,尤其以Ⅲ组（IL-3,6,2,4）第7d的扩增为最高：单个核细胞总数达（17.11±6.12）×109个/L,CD34＋细胞比率达（9.92±2.56）%。结论细胞因子可以提高脐血单个核细胞和CD34＋细胞的扩增效率,SCF＋IL-3＋6＋2＋4的组合在第7d时达到了最佳的扩增。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

条件培养液对脐血CD_(34)~+细胞扩增效应的实验研究

目的探讨并分析不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法利用 4种条件培养液 (胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞 )对脐血CD+ 34 细胞进行 2周的体外扩增 ,并和三细胞因子组合 :干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)、血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)、flt 3配基 (flt 3ligand ,FL) ,对脐血CD+ 3 4 细胞扩增结果进行了比较 ;利用ELISA方法检测 4种条件培养液中细胞因子 [白细胞介素 1(interleukin 1,IL 1)、白细胞介素 6 (interleukin 6 ,IL 6 )、FL、TPO]的浓度。结果脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD+ 3 4 细胞均有明显的扩增效应 ,脐血组优于细胞因子组合 ;4种条件培养液中 ,脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD+ 34 细胞有效而廉价的扩增剂 ;细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞体外扩增结果差异的主要因素     

条件培养液对脐血CD34^＋细胞扩增效应的实验研究

目的：探讨并分析不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法：利用4种条件培养液（胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞）对脐血CD34^ 细胞进行2周的体外扩增，并和三细胞因子组合：干细胞因子（stem cell factor,SCF)，血小板生成素（thrombopoietin,TPO),flt-3配基（flt-3 ligand,FL)，对脐血CD34^ 细胞扩增结果进行了比较；利用ELISA方法检测4种条件培养液中细胞因子[白细胞介素－1（interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、FL、TPO]的浓度。结果：脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD34^ 细胞均有明显的扩增效应，脐血组优于细胞因子组合；4种条件培养液中，脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论：脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD34^ 细胞有效而廉价的扩增剂；细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞体外扩增结果差异的主要因素。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

脐血CD34~+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 + 细胞体外扩增理想的细胞因子组合     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

牙周膜干细胞对脐血单个核细胞分化为破骨样细胞的影响

目的研究牙周组织改建过程中,牙周膜干细胞对破骨细胞形成的影响,初步探讨静压力和诱导因子对牙周膜干细胞调控破骨细胞形成的作用机制。方法有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,密度梯度离心法分离脐血,收集单个核细胞。建立直接共培养和Transwell间接共培养体系。实验分组:A组,对照组(单纯共培养);B组,静压力组,共培养后第2天即对共培养细胞施加120 KPa压力,持续作用1 h后继续培养;C组,诱导因子组,培养液中加入诱导因子1,25二羟基维生素D3(1×10-8mol/L)和前列腺素E2(1×10-6mol/L)。采用倒置相差显微镜及TRAP染色,骨磨片染色等方法检测破骨样细胞(osteoclast-like cells,OLC)的形成及功能。结果各组第3、7天OLC计数比较结果显示,施加静压力后,直接共培养组OLC数量明显多于间接共培养组(P<0.01);而诱导因子组,直接共培养组OLC少于间接共培养组(P<0.01)。结论牙周膜干细胞能够促进脐血单个核细胞分化为破骨样细胞,且在静压力作用下,两种细胞直接接触时,这种调控作用更为明显。     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞及其与脐静脉内皮细胞的比较

目的：研究干细胞定向分化为内皮细胞的效率,并与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)比较。方法：用两步法诱导干细胞HUES9分化为内皮细胞,前3 d在N2B27培养基中加入骨形态发生蛋白4 (25 ng/mL)和肝糖原合成激酶3β受体的选择性抑制剂CHIR99021(10 μmol/L)使细胞分化到中胚层状态,第4天开始用 VEGF165(200 ng/mL)和Forskolin(2 μmol/L)将细胞诱导为内皮细胞。观察分化第6天细胞形态,并与HUVECs比较。用 CD144作为内皮细胞表面标志物,流式细胞术检测分化效率及分化后细胞的身份。比较两种内皮细胞迁移和成管能 力。结果：分化后的内皮细胞与HUVECs在显微镜下形态一致。分化细胞表面标志物阳性率达到73.4%,重新培养后 的内皮细胞表面CD144阳性率达到86.6%,HUVECs为94.4%。分化后的内皮细胞与HUVECs均具有良好的迁移和成管 能力,但分化后的内皮细胞能力不如HUVECs强。运用SB431542后,能够提高分化后内皮细胞的迁移和成管能力。 结论：此两步法将干细胞分化为内皮细胞有较高的分化效率,可作为理想的分化方法。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

人胚胎原生殖细胞中胚胎干细胞的分离培养

目的：探讨人胚胎原生殖细胞分离培养的条件及在体内、外的分化能力．方法：从5～9wk人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC），将其置于饲养层上培养，采用大鼠心肌细胞条件培养基(RH-CM)，改变了常规使用添加白血病抑制因子(LIF)的培养液．结果：成功地完成了对PGC的第4代培养；经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合胚胎干细胞(ES)的特性：AP染色呈阳性；体外分化实验显示此细胞具有发育多能性；悬浮培养时能够自然分化成类胚体(EB)．结论：离散生殖嵴和增殖的。PGC克隆的时机和方法是影响建系的关键；PMEF和HEF对人PGC克隆的影响无显差异；添加RH-CM可有效抑制PGC的分化。     

特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对黑色素瘤抑瘤作用的比较

目的：比较特异性抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导的杀伤细胞（CIK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法：采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK和CTL细胞共同培养,分析其免疫表型,流式细胞检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数（AI）、细胞增殖指数（PI）的变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的抑瘤作用。结果：DC-CIK及DC-CTL均可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并具有诱导细胞凋亡的作用,但DC-CIK与DC-CTL之间无显著性差异;DC-CTL细胞组抑瘤作用较DC-CIK明显升高。结论：特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对B16黑色素瘤均有抑瘤作用,但DC-CTL更高效而特异。