新型隐球酵母cap 70 荚膜缺陷株转化系统的建立

目的：构建新型隐球菌荚膜缺陷株cap70的转化系统。方法：⑴在新型隐球菌的荚膜缺陷株cap70中利用5-氟乳清酸（5-FOA）反选择法筛选尿嘧啶合成基因突变株（cap70 ura5),并用Southern杂交和PCR方法对突变株作进一步验证;⑵利用ura5及ura3为选择标记的质粒载体pCXJ18及pCXJU,用电转化法和化学转化法转化ura5突变株。结果：筛选到ura5突变株,经验证该突变株尿嘧啶合成功能缺失;首次用化学转化法在新型隐球菌的转化中获得高效率转化。结论：首次建立了新型隐球菌cap70荚膜缺陷株的转化系统,为克隆与荚膜形成有关的新基因提供了基础,并为以基因中断、基因替代方法研究基因功能及基因表达等方面的工作创造了条件。     

影响新生隐球菌毒性及其他表型改变的微观进化

目的 :探讨微观进化在新生隐球菌感染中的作用。　方法 :取标准的产黑素和白化突变菌株分别培养 ,研究产黑素表型的变化 ,并用聚合酶链反应进行CNLAC1目的基因片段的扩增。　结果 :产黑素在转种培养后未见变化 ,而CNLAC1基因片段扩增时 ,发现转种后的菌株发生细微变化。　结论 :新生隐球菌微观进化现象不超越菌种 ,甚至表型都不发生明显变化 ,这为菌种保藏可能提供一个更早期的参考指标。     

新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株。方法：(1)用体外基因重组技术将G418抗性基因插入到新生隐球菌1．2kb的ura5基因中;(2)用电转化方法将体外重组片段导入受体菌;(3)利用5-氟乳清酸(5-FOA)反筛选法筛选ura5突变株;(4)用遗传学鉴定营养缺陷株的方法鉴定突变体。结果：1株突变株ura5基因的序列与重组片段相同;其Southern杂交显示在20kb和7kb处出现2条杂交条带;该突变株能在SDU、SDU和YEPD／G418平板上生长,不能在SD平板生长;其生长曲线显示突变株生长速度依赖于尿嘧啶的提供量。结论：获得了1株新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株,建立了新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株转化系统,为CAP64基因的功能研究提供了工具。     

PCR对新生隐球菌的基因分型研究

目的：用AP-PCR方法检测新生隐球菌的临床和环境分离株,观察PCR指纹与血清型的关系。探索PCR指纹对于新生隐球菌的分型标准。方法：采用3种寡核苷酸重复序列即CN1[（GTG5）]、CN2[（GACA）4]和CN3[（GATA）4]为引物对从患和鸽粪中分离到的48株新生隐球菌DNA进行扩增,根据圹增产物的电泳带型对比PCR指纹和血清型之间的关系。结果：38株血清A型株中,34株有完全相似的DNA带型,另4株中1株与血清D型的DNA带型相似,3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型的带型均不相同,各有独特的PCR指纹带型。2株B型和2株C型产生几乎完全一致的PCR指纹带型,3株D型和3株其他隐球菌则各自产生特定的DNA带型。结论：（1）大多数血清A型产生隐球菌株具有相似PCR指纹带型;（2）血清B型和C型（gattii变种）的PCR指纹不易区别,相同血清型不同的株可能有不同的PCR指纹带型;（3）PCR指纹法用于新生隐球菌菌株鉴定的一种快速、方便、可行的方法。     

耐异烟肼结核分枝杆菌katG基因突变快速筛选的研究

目的：建立结核分枝杆菌（MTB）katG基因点突变的筛选方法，了解结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）的状况。方法：采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（PCR－RFLP）技术，对8株耐INH的临床MTB分离株、16株对INH敏感的临床分离株及MTB标准株H37Rv的katG基因，进行聚合酶链（PCR）反应扩增katG基因片段，再用Msp I内切酶分别对PCR产物进行消化反应。如果有315位点AGC突变为ACC，则将增加一个切点。结果：检测到8株耐药株中有7株增加了一个Msp I内切酶切点，耐药株中katG基因点突变检出率为87．5％（7／8）；16株敏感株和标准株均无额外的Msp I内切酶切点。未发现katG基因序列的缺失。结论：katG基因点突变是MTB耐INH重要机理之一；用PCR－RFLP检测耐INH的MTB的katG基因点突变具有快速、简便、敏感性高、特异性强的特点。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

幽门螺杆菌rdxA基因突变与耐药性关系的研究

目的：探讨幽门螺杆菌（Hp）临床菌株rdxA基因变异与甲硝唑耐药性的关系。方法：从患者胃粘膜活检标本中分离培养Hp。采用纸片扩散法初筛和二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝唑的耐药性。提取21株Hp基因组DNA进行PCR扩增，T-A克隆后测序，与文献报道的Hp26695株及134株临床分离株rdxA基因序列进行比较。结果：76.1％（15/21）的Hp菌株对甲硝唑耐药。PCR可扩增出886bp的rdxA基因的片段。与Hp26695株rdxA基因序列比较，扩增产物核苷酸序列的同源性为90.1％-95.1％。甲硝唑耐药菌株rdxA基因出现碱基插入/缺失及碱基替换而引起的突变。结论：rdxA基因突变是Hp对甲硝唑耐药的重要因素。     

屎肠球菌类透明质酸酶基因突变株的构建及功能研究

目的构建屎肠球菌类透明质酸酶基因（hyl）突变株,研究hyl基因的功能。方法用自杀质粒pTx4577通过体内同源重组,筛选获得hyl基因的突变株,研究体外hyl基因缺失对突变株生长能力的影响。通过小鼠腹膜炎和兔心内膜炎模型研究体内突变株的毒力情况。结果经同源重组,利用卡那霉素抗性筛选,PCR、脉冲场电泳和Southern印迹进行鉴定获得hyl基因突变株＋hyl,突变株在体外的生长能力低于野生株。小鼠腹膜炎模型中,在相同细菌感染浓度（3．7×10^9CFU／m1）下,野生株TX2466组小鼠在100h内的存活率为0,而＊hyl组小鼠的存活率为50％,差异有统计学意义（P〈0．01）。兔心内膜炎模型中,TX2466组主动脉瓣和壁性赘生物的菌落计数分别为（3．04±0．63）×10^6CFU／g和（6．87±0．58）×10^6CFU／g,而＊hyl组则分别为（0．21±0．06）×10^6CFU／g和（0．66±0．05）×10^6CFU／g,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论hyl基因突变株构建成功,hyl基因在屎肠球菌致病中起着重要的作用,可能是屎肠球菌的毒力因子之一。     

缺失激素结合区的人糖皮质激素受体突变体的研究

目的：构建缺失激素结合区（LBD）的人糖皮质激素受体突变体表达载体，并研究其表达和功能。方法：运用RT-nested PCR扩增人糖皮质激素受体（CR）基因不含编码LBD的cDNA序列，将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体，测序筛选编码正确的重组质粒；荧光显微镜观察GR突变体重组质粒转染人巨噬细胞株U937后的表达情况；相对荧光素酶法检测转染后细胞GR转录激活活性。结果：扩增出长1601bp的cDNA序列，测序证实：克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100％；重组质粒表达产物定位于细胞核；转染组细胞GR转录激活活性增强。结论：成功构建缺失LBD的GR突变体表达载体，该突变体具有不依赖激素的GR转录激活活性。     

新生隐球菌荚膜基因CAP60对菌体荚膜形成的影响

目的：研究新生隐球菌荚膜相关基因CAP60对菌体荚膜形成的影响。方法：用PCR方法分离CAP60基因并测序鉴定，将该基因导入转化载体并转化cap60ura^-菌株，乳胶凝集试剂盒筛选转化分子。结果：部分转化子恢复莱膜的表型，表明得到的片段具有荚膜基因功能。结论：荚膜基因对新生隐球菌的荚膜形成都是必须的，缺失其中的任何一个基因都会使新生隐球菌变成无荚膜表型。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

人乙酰肝素酶核心启动子的扩增及序列分析

目的:扩增乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)基因启动子核心片段,并进行序列分析。方法:提取人类基因组DNA,PCR扩增HPSE基因启动子,T-A克隆、酶切鉴定,然后进行测序比对,分析其中转录因子结合位点。结果:从人类基因组DNA中扩增出HPSE基因启动子片段,酶切鉴定与预期结果吻合,长度为561bp,该启动子碱基序列与数据库GenBank完全一致,并含有3个Sp1、4个ERE和2个ERG1转录因子结合位点。结论:成功克隆了HPSE核心启动子,并含有维持HPSE转录活性的转录因子结合位点,为后续研究奠定了基础。     

Taxonomic analysis of cryptococcus species complex strain S8012 revealed Cryptococcus gattii with high heterogeneity on the genetics

Background  Initially, Cryptococcus (C.) neoformans was previously divided into two varieties comprising C. neoformans var. neoformans and C. neoformans var. gattii. Currently, taxonomic studies defined C. neoformans as C. species complex, which contains C. neoformans var. neoformans (serotype D), the hybrid isolates (serotype AD), C. neoformans var. grubii (serotype A) and C. gattii (serotypes B and C). However, Liao and his team once isolated a unique C. gattii isolate, namely strain S8012 with unique phenotype from cerebrospinal fluid (CSF) of a 43-year-old male patient in the Shanghai Changzheng Hospital and described as C. neoformans var. shanghaiensis in 1980s. The aim of this study was to explore the genetic background and polymorphism of Chinese clinical C. gattii isolates.

Methods  S8012 was analyzed as representative strain using the M13-polymerase chain reaction (PCR) fingerprinting pattern and multilocus sequence analysis including internal transcribed spacers of rDNA (ITS region), the intergenic spacer 1 regions (IGS1), RPB1, RPB2, CNLAC1, and TEF1 genes.

Results  The PCR fingerprinting pattern results showed strain S8012 belonged to molecular types VGI, and phylogenetic analysis suggested strain S8012 was grouped into the cluster of C. gattii environmental isolates originated from Eucalyptus camaldulensis trees in Australia.

Conclusion  C. gattii isolates from Chinese patients expresses high polymorphism on the phenotype, and molecular type VGI isolates from China have a close genetic relationship with the C. gattii isolates from Australia.

     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

豫医无毛小鼠无毛基因部分内含子突变研究

目的 研究豫医无毛小鼠突变的分子机制。方法 对豫医无毛小鼠和昆明小鼠的基因组DNA进行PCR扩增,对二者扩增片段克隆后测序,对结果进行比较,以确定豫医无毛小鼠无毛基因的特异性程度。结果 本实验共测出豫医无毛小鼠DNA序列1746bp和昆明小鼠DNA序列1733bp,两者不同之处有32处,均位于内含子,突变形式包括插入、缺失和点突变。结论 无毛性状的产生可能与内含子中的插入、缺失和点突变有关。     

TGF-β1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建人转化生长因子-β1（TGF-β1）的真核表达载体,并检测其融合蛋白在真核细胞COS-7中的表达,为阐明TGF-β1在肝纤维化发生、发展中的作用以及建立相应的基因沉寂治疗途径奠定基础.方法：从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western Blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达.结果：通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致; 测序结果显示,于531位有1个碱基突变：T→C,为无义突变.通过RT-PCR和Western Blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子质量约为52ku（绿色荧光蛋白分子质量约为27ku）,说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达.结论：成功的构建了真核表达质粒pEGFP-N1-TGF-β1,并在真核细胞COS-7中表达,为进一步研究其在肝纤维化的基因治疗中奠定了基础.