Isolation and Purification of Cellulase Produced by Mixed. Fermentation of AspergiUus niger Ⅲ and Trichoderca viride Ⅰ and Their Enzymatic Properties

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100 凝胶柱层析,得到 5 个洗脱峰,其中峰 2 含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰 3 含内切酶、外切酶及 ?-葡萄糖苷酶,酶系较全;峰 5 含内切酶和外切酶;峰 1 和峰 4 没有纤维素酶活性。采用 DEAF FF 弱阴离子交换柱层析对峰 2 进行了分离纯化,从中分离纯化得到一种内切葡聚糖苷酶组分,经 SDS-PAGE 电泳分析,其分子量为 61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC 酶活在 pH4.0～6.0 的条件下,可保持初始酶活的 70 %～80 %,最适酶反应 pH 为 5.0;温度在 30～50 ℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为 50 ℃,若超过 60 ℃,酶活迅速下降。     

窖泥中产纤维素酶菌株的筛选鉴定及产酶特性的研究

纤维素酶能够把纤维素降解成可发酵性糖,在许多工业领域有着广阔的应用价值。以窖泥为材料,采用传统平板法对产酶菌株进行筛选,获得一株产纤维素酶系齐全、活性强的菌株XWS-A,经16S rDNA分子生物学鉴定,结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌。在液态条件下,对该菌株产酶特性进行研究发现,产内切β-葡聚糖酶最佳条件为温度35℃,培养基初始pH5.5,培养时间72 h;产外切β-葡聚糖酶最佳条件为温度35℃,培养基初始pH6.0,培养时间72 h;产β-葡萄糖苷酶最佳条件为温度40℃,培养基初始pH6.0,培养时间72 h。进一步对其酶学性质进行研究,结果表明:内切β-葡聚糖酶最适反应温度是50℃,最适反应pH为5.5;外切β-葡聚糖酶最适反应温度是50℃,最适反应pH为6.0;β-葡萄糖苷酶最适反应温度是50℃,最适反应pH为6.0。     

康氏木霉诱变菌株纤维素酶系的分离纯化与酶学特性研究

探讨来源于康氏木霉诱变菌株SG0026 10L发酵罐发酵液中纤维素酶系的分离纯化过程及其酶学性质。采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析柱和CM-Sepharose FF阳离子交换层析等分离纯化技术,从康氏木霉诱变菌株发酵液中分离纯化得到3个电泳纯的纤维素酶系组分(内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)。对纯化的电泳纯内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活进行测定,发现3种酶的比活力分别为4.67±0.06 IU/mg、5.16±0.08 IU/mg和12.52±0.12 IU/mg。采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定其分子量,发现其分子量分别为78.1、91.2和83.1k Da。利用Linewaeaver-Burk法对3种酶的动力学参数进行测定,发现3种酶的Km值分别为3.84、6.62和6.21 mg/m L,Vmax值分别为2.29、1.74和2.19 mg/(min·m L)。在此基础上,对3种酶的反应温度和pH进行了研究,发现3种酶的最适反应温度分别为50、50和55℃,最适反应pH均为5.0。     

一株广西红树林青霉属菌株纤维素酶的纯化及酶性质研究

一株广西红树林青霉属菌株经液态发酵,提取纤维素酶粗酶液,经硫酸铵盐析,Sephadex G-25脱盐和Sephadex G-100柱层析,高效液相色谱结果显示出3个峰。根据标准蛋白质分子量大小和保留时间得出3种酶的相对分子质量分别为56.4ku、52.6ku和49.0ku,初步判断分别是β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶EG和外切葡聚糖酶CBH,EG的纯化倍数和酶活回收率分别为8.5倍和26.5%,CBH的纯化倍数和酶活回收率分别为29.0倍和87.6%,滤纸酶FPase的纯化倍数和酶活回收率分别为16.9倍和57.2%。酶学性质表明该纤维素酶系最适反应条件为:CMC为55℃、pH值为3.2;CBH为45℃、pH值为3.2;FPase为55℃、pH值为3.6,其最大酶活分别为:1262U/mL、612U/mL和943U/mL。     

耐热解淀粉芽孢杆菌BA-DES4产纤维素酶的分离纯化及酶学性质

目的：本研究以一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌BA-DES4为材料,纯化并研究了其纤维素酶的酶学性质。方法：研究采用硫酸铵分级沉淀及SephadexG-75凝胶过滤层析方式对其所产纤维素酶进行分离纯化,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其分子量,并对纯化后纤维素酶的酶液进行酶学性质研究。结果表明：发酵液中分离纯化获得纤维素酶系组分（内切葡聚糖酶）,对纯化的电泳内切葡聚糖酶进行酶活测定,其比活力为51.08 U/mg。发现其分子量为22.4 kDa;初步酶学性质研究表明：该酶的最适反应温度和最适pH分别为65℃和6.0,且在pH5.0～7.0和温度55～65℃下稳定性较高;Mn2+对纤维素酶活力激活作用较为显著,Cu2+的抑制作用最大。结论：该菌株可作为产内切葡聚糖酶的潜在菌株,内切葡聚糖酶可在Mn2+、Fe2+的作用下促进酶活力,同时在高温及酸性环境中发挥作用,能够参与高效降解高温酸性环境中的纤维素,提高生产率,同时将分解成的葡萄糖供发酵使用,具有应用高温大曲发酵酒生产的潜力,为该酶的进一步研究奠定了基础。     

降解纤维素复合菌系F-7产纤维素酶的分离纯化及性质研究

目的:对真菌复合菌系F-7所产纤维素酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。方法:通过(NH4)2SO4分级沉淀、透析、葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-75分离纯化技术,分离纯化来源于葡萄座腔菌属、米根霉、尖孢镰刀菌混合纤维素酶液中的内切葡萄糖苷酶。结果表明,CMC酶活在p H3.0~7.0的条件下,最适反应p H值为4.8,最适反应温度为50℃,超过60℃酶活迅速下降。结论:经凝胶层析柱Sephadex G-75和SDS-PAGE后第一个峰已纯化,得到了一种相对分子量约为66.2 ku的纤维素酶。分离纯化后该酶的比活力提高了1.75倍,回收率为20%。为进一步研究此纤维素酶的组分、结构和理化特性奠定了基础。     

草菇纤维素酶系统的诱导、分布及初步定性

以蔗糖、果胶、羧甲基纤维素、木聚糖或稻草为碳源培养草菇(Volvariellavolvacea),并对它所产生的纤维素酶进行初步研究,发现纤维素酶系主要是由纤维素诱导产生.纤维素酶中的β 葡萄糖苷酶和纤维二糖酶分布在胞内,内切葡聚糖酶分布在胞外.β 葡萄糖苷酶的最适反应温度为60℃,最适pH为6.6,在pH6.6～7.8时比较稳定,保温1h酶活的半衰温度是45℃.纤维二糖酶的最适反应温度为50℃、最适pH为5.8,在pH6.2最稳定,保温1h酶活的半衰温度是44℃.内切葡聚糖酶的最适反应温度为60℃,最适pH为5.4,在pH6.6～7.0时比较稳定,保温1h酶活的半衰温度是58℃.     

九孔鲍鱼纤维素酶的分离纯化与性质分析

采用SP-Sepharose阳离子葡聚糖凝胶交换柱层析、Sephacryl S-200丙烯葡聚糖凝胶柱层析和Hydrox-yapatite羟基磷灰石柱层析,从九孔鲍鱼(Haliotis diversicolor)消化腺中分离纯化到一种纤维素酶。SDS-PAGE结果显示,该酶的分子质量约为55kDa。该酶水解羧甲基纤维素钠的最适温度50℃,最适pH5.5。该酶在温度40℃以下,pH5.0～7.0之间具有较好的稳定性。     

南美白对虾虾头内源酶的分离纯化

对南美白对虾虾头的内源酶进行分离纯化及酶学性质的研究。利用正交正交试验优化了硫酸铵粗提内源酶最佳工艺条件:缓冲溶液pH6.8,硫酸铵一级沉淀饱和度20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。虾头内源酶经硫酸铵分级沉淀后,再经Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化,得到组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3个酶活峰。对酶活最高的组分I进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析,表明组分Ⅰ中主要活性酶分子质量约为41.0kDa。凝胶层析分离组分Ⅰ最适作用pH为7.0～9.0,最适作用温度为60～70℃。     

耐热黑曲霉3.316产外切葡聚糖苷酶培养基优化及酶学性质研究

以外切葡聚糖苷酶的酶活力为指标,对黑曲霉产外切葡聚糖苷酶的培养基组分进行优化,并研究外切葡聚糖苷酶酶学性质。单因素和响应面法对黑曲霉3.316产外切葡聚糖苷酶培养基条件优化结果表明,最佳培养基组分为:小麦秸秆14.73 g/500 mL,硫酸铵2.22 g/500 mL,微晶纤维素+麦芽糖2.18 g/500 mL,在该条件下外切葡聚糖苷酶2.120 U/mL,酶活力较未优化前相比提高了91%。外切葡聚糖苷酶最适温度是50 ℃。外切葡聚糖苷酶在50 ℃较稳定,相对酶活保持在98%~99%范围内。外切葡聚糖苷酶在pH为3.0、7.0时表现出较高的稳定性,相对酶活在70%以上。外切葡聚糖苷酶能够在Fe2+和表面活性剂的作用下促进酶活力,同时在高温及酸性环境中发挥作用,能够参与高效降解高温酸性环境中的纤维素,提高生产率,同时将分解成的葡萄糖供发酵使用,具有应用高温大曲发酵酒生产的潜力。     

节杆菌β-1,3葡聚糖内切酶的分离纯化与特性研究

通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和柱层析从节杆菌（Arthrobacter sp．）粗酶制剂分离纯化得到β-1,3葡聚糖内切酶。经SDS凝胶电泳和柱层析测得纯化酶为单体酶,分子量为32．5kDa;纯化酶N末端的10个氨基酸序列为APGDLLWSDE,在pH5～8之间稳定,最适pH6．5,最适温度55℃,但50℃以上失活很快。纯化酶对昆布4,5,6,7糖及昆布多糖底物的米氏常数分别为0．12,0．11,0．067,0．066mM和0．16mg／mL,也可水解热凝胶和地衣多糖,葡糖苷内切酶H（Streptomyces griseus）不能分解它,证明该酶不含糖基。该酶属于糖基水解酶16族系。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化研究初探

目的研究玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化的方法。方法以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)菌株为材料,分离纯化其内切葡聚糖酶Egase。制备EGase浓缩液,浓缩液经Sephradex~(TM)G-75凝胶过滤层析和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换柱层析等提纯步骤,获得了凝胶电泳均一的内切葡聚糖酶。结果经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带,纯化后的EGase是单体蛋白,分子量约为72.3 k Da。Egase酶反应的最适温度是60℃,最适pH为5.0。结论本研究从玉米细菌性枯萎病菌中分离得到了一种新的内切葡聚合糖酶,对其部分性质进行了表述,为后续EGase基因的克隆及表达研究提供了研究基础。     

内切葡聚糖酶与木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达

为实现内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中的共分泌表达,进而降低酶制剂的生产成本,构建含木聚糖酶基因的重组表达载体pPICZαA-Aoxyn11A,经SacI线性化后,电转化至含内切葡聚糖酶基因Aucel12A的重组毕赤酵母GSC7中,获得双重重组毕赤酵母GSCX8。经甲醇诱导表达后,GSCX8发酵上清液中内切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分别为47.77IU/mL和192.71IU/mL,为单独表达菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶学性质分析显示,内切葡聚糖酶的最适pH为4.0,在pH3.0~8.5稳定;最适温度为50℃,在60℃以下稳定。木聚糖酶的最适pH为5.5,在pH3.0~10.0稳定;最适温度为55℃,在50℃以下稳定。GSCX8遗传稳定性测试结果表明,内切葡聚糖酶和木聚糖酶在毕赤酵母中实现了稳定的共表达。     

耐热黑曲霉3.316产内切葡聚糖苷酶培养条件优化及酶学性质研究

以内切葡聚糖苷酶的酶活力为指标,采用单因素结合和响应面法对黑曲霉产内切葡聚糖苷酶的培养基组分进行优化,并研究内切葡聚糖苷酶酶学性质。结果表明:最佳培养基组分为小麦秸秆16.29 g/500 mL,硫酸铵2.24 g/500 mL,微晶纤维素+麦芽糖2.16 g/500 mL,在该条件下内切葡聚糖苷酶酶活力4.257 U/mL,优化后的酶活力提高了86%。内切葡聚糖苷酶最适温度是60℃,热稳定性在50℃较高;内切葡聚糖苷酶最适pH值是3,稳定性在5时较高。动力学模型表明以羧甲基纤维素钠为底物的内切葡聚糖苷酶Km=0.0211 mol/L,Vm=0.0036 mmol/min。内切葡聚糖苷酶能够在高温及酸性环境中发挥作用,参与高效降解高温酸性环境中的纤维素,提高其生产率,具有应用高温大曲发酵酒生产的潜力。     

纤维素酶的主要酶学性质的研究

用DNS为显色剂,以滤纸和CMC为底物,测定纤维素酶A的滤纸酶活和CMC酶活(PA和CMCA),探讨纤维素酶A的主要酶学性质。结果表明:FPA和CMCA的最适温度范围为50℃～60℃和50℃～70℃;最适pH为5.0和4.6～5.0。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70%的（NH4）2SO4及DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28.7倍,酶回收率为45.2%。经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0～5.0、温度30～70℃酶活相对稳定。Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋以及Cu^2＋对该酶有抑制作用,Zn^2＋、Ca^2＋和Fe^2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性

近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明:F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变:D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。     

Aspergillus ticuum菊粉酶酶学性质的研究

本实验对Aspergillus ticuum产菊粉酶体系中的外切菊粉酶和内切菊粉酶的酶学性质进行了研究,研究表明二者酶学性质非常相似:两种酶的最适反应温度均在45℃左右;外切菊粉酶的最适反应pH为4.5,内切菊粉酶为pH5.0; Ag 完全抑制两种酶的活性,Fe2 和Al3 对两种酶有较强的抑制作用,尤其是外切菊粉酶,Mg2 对两种酶有激活作用;实验还对两种酶的动力学常数进行了测定和比较.