血管内皮生长因子反义寡核苷酸对人白血病细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)反义寡脱氧核苷酸 (AS ODN)对人白血病细胞系VEGF表达的影响。方法　将VEGFAS ODN与K5 6 2和HL 6 0细胞共孵育 ,采用RT PCR技术、免疫组化方法以及ELISA法观察VEGFAS ODN对人白血病细胞系VEGFmRNA和蛋白水平的影响。应用MTT法观察VEGFAS ODN作用后的白血病细胞培养上清对人脐静脉血管内皮细胞 (ECV30 4 )增殖的影响。结果　K5 6 2细胞和HL 6 0细胞经VEGFAS ODN(2 .5～ 15 .0 μmol L)作用 2 4h后 ,VEGFmRNA的表达量呈剂量依赖性减少 ,而其表达量不受VEGF错义ODN的影响 ;当加入 5 .0 μmol LVEGFAS ODN作用 2 4h后 ,细胞内及其培养上清液中VEGF蛋白水平显著减少 ,其培养上清对ECV30 4细胞的促增殖作用减弱 ,而错义ODN处理组白血病细胞VEGF蛋白水平及其作用未见明显改变。结论　VEGFAS ODN在体外能够抑制人白血病细胞VEGF的表达。     

survivin反义寡核苷酸诱导淋巴瘤细胞凋亡及对化疗药的增敏作用

目的　观察survivin反义寡核苷酸 (ASODN)对淋巴瘤细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法　人工合成survivin硫代ASODN ,通过脂质体转染淋巴瘤细胞株Raji后 ,用MTT法检测细胞毒作用 ;用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡 ;RT PCR、Westernblot检测survivinmRNA及蛋白的表达。结果　①survivinASODN抑制Raji细胞增殖呈时间和剂量依赖性 ;②survivinASODN处理组Raji细胞凋亡率为 33.0 % ,正义寡核苷酸 (SODN)组为 11.5 % ,两组相比 ,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;③survivinASODN处理组Raji细胞survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降 ;④survivinASODN和Vm2 6联合处理组Raji细胞增殖受抑率为 5 6 .5 % ,显著高于单用survivinASODN组的 2 9.2 % (P <0 0 5 )和单用Vm2 6处理组的 2 6 .9% (P <0 .0 5 )。结论　survivinASODN能够抑制Raji细胞增殖、诱导凋亡 ,并能增加Raji细胞对化疗药物的敏感性 ,推测可能通过下调survivinmRNA及蛋白表达而起作用。     

反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌抑制作用的研究

目的 研究反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌牛长的抑制作用,探讨其潜在的抗结核作用.方法 在7H9培养基中接种5×10~5 CFU耻垢分枝杆菌MC~2155,同时加入20μmol/L针对结核分枝杆菌中必须基因Rv3806c在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸.以耻垢分枝杆菌MC~2155单独培养作为对照.观察和绘制细菌生长曲线;测定细胞膜MSMEG_6401编码的磷酸核糖转移酶的生物活性;应用高压气相色谱测定耻垢分枝杆菌细胞壁中糖的含量.结果 anti-ODNs作用6 d后的耻垢分枝杆菌平均吸光度值(A值)为0.84±0.09;而野生型耻垢分枝杆菌平均,4值为1.27±0.01,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.45(P<0.01);anti-ODNs作用6 d后耻垢分枝杆菌平均CFU计数的对数值为8.27±0.19;而野生型耻垢分枝杆菌平均CFU对数值为8.89±0.14,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.62个log单位;在应用等量的膜蛋白的情况下,实验组磷酸核糖转移酶的生物活性降低约40%;试验组和对照组细菌反映细胞壁糖含量的指标甘露糖-半乳糖/阿拉伯糖比值没有明显差异(2组实验组分别为0.63和0.69;2组对照组分别为0.67和0.69).结论 针对MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌的增殖有一定程度的抑制作用,推测反义寡脱氧核苷酸技术有一定抗结核价值;结核分枝杆菌的Rv3806c基因或是其编码产物可能是一个好的抗结核药物作用靶位.     

MAPK反义寡核苷酸对肝癌细胞恶性表型的逆转作用

目的:探讨MAPK反义寡核苷酸对肝癌细胞恶性表型的逆转作用。方法:用脂质体转染法将MAPK反义寡核苷酸导入肝癌细胞株SMMC-7721中,通过细胞活力、蛋白质含量、集落形成和DNA合成的变化检测MAPK反义寡核苷酸对肝癌恶性表型的逆转作用。结果:MAPK反义寡核苷酸可明显抑制细胞活力、蛋白质含量、集落形成和DNA合成,其抑制率分别为52.6%、50.5%、54.9%和47.5%,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:MAPK反义寡核苷酸可逆转SMMC-7721细胞恶性表型,也为肝癌治疗指出了新方向。     

Survivin反义寡核苷酸联合AsI3-cys对K562细胞凋亡的影响

目的:探讨Survivin反义寡核苷酸(ASODN)联合AsI3-cys对K562细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的诱导作用。方法:K562细胞体外培养,人工合成并硫代修饰Survivin ASODN,通过脂质体转染进入K562细胞,同时与AsI3-cys联用,MTT法检测细胞增殖抑制程度,Tunel法检测细胞凋亡指数,RT-PCR检测细胞中Survivin mRNA的表达水平,流式细胞仪检测细胞周期的变化和细胞凋亡率。结果:Survivin ASODN各浓度组对K562细胞的增殖有明显的抑制作用,能明显诱导细胞凋亡,联用组诱导K562细胞凋亡的能力与其他组相比在统计学上差异有显著性。结论:Survivin ASODN能够诱导K562细胞凋亡,并提高K562细胞对AsI3-cys的敏感性。     

凋亡抑制基因survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸诱导肺癌细胞株凋亡的实验观察

目的：探讨凋亡：抑制基因survivin反义寡核苷酸单用或联用bcl-2反义寡核苷酸对肺癌细胞株的作用，探讨其在抗癌方面的作用。方法：①实验于2002-08／2003-04在蚌埠医学院免疫学实验室完成。将对数生长期NCI—H446细胞分为6组：空白对照组，脂质体10mg／L组（仅加空脂质体），NSODN 500nmol／L组（该3组均为对照组），survivin反义寡核苷酸500nmol／L组，bcl-2反义寡核苷酸5μmol／L，survivin反义寡核苷酸500nmol／L＋bcl-2反义寡核苷酸5μmol／L组（分别在脂质体介导下转染不同寡核苷酸，48h后收取细胞进行以下检测）。②在脂质体介导下，以survivin的反义寡核苷酸作用于肺癌细胞株NCI-H446和SPC—A1，于72h用反转录聚合酶链反应检测survivin mRNA表达。凋亡指数：（静止期／DNA合成前期）占整个细胞周期的百分比；增殖指数=（DNA复制期＋合成后期／有丝分裂期）占整个细胞周期的百分比。②survivin反义寡核苷酸单独或联合bcl-2反义寡核苷酸作用NCI—H446后，用四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长抑制率并计算两药相互作用指数，锥虫蓝拒染实验检测细胞死亡率。（3）计量资料差异性比较采用方差分析和q检验。结果：①两种肺癌细胞株皆表达survivin基因。survivin反义寡核苷酸作用细胞株后，出现生长抑制和细胞凋亡，细胞survivin mRNA明显下调，反义寡核苷酸500nmol／L作用72h后NCI—H446和SPC—A1细胞survivin mRNA抑制率分别达62．72％和67．43％。②四甲基偶氮唑盐法检测结果显示，survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸单独应用对NCI—H446细胞均有生长抑制作用；联合应用survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸的细胞生长抑制率为64．9％，优于单独应用（单用bcl-2反义寡核苷酸为34．2％）（P〈0．01），两药相互作用指数为0．708。锥虫蓝拒染实验显示，survivin反义寡核苷酸500nmol／L＋bcl-2反义寡核苷酸5μmol／L组细胞死亡率为62．1％，高于两药单用时的31．4％和41．4％。流式细胞仪检测凋亡显示，与各对照组相比，survivin反义寡核苷酸和bcl-2反义寡核苷酸均可诱导细胞凋亡，凋亡率分别为43．6％和30．7％，两者联用凋亡率提高到58．6％（p〈0．01）。结论：①survivin反义寡核苷酸能抑制肺癌细胞株survivin基因表达，并诱导细胞凋亡和抑制生长。②survivin反义寡核苷酸联合bcl-2反义寡核苷酸具有显著协同抗癌作用。     

抗端粒酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞增殖的影响

目的：观察抗端粒酶反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞系端粒酶活性的抑制作用及其对癌细胞增殖的影响。方法：合成与人类端粒酶RNA模板区碱基序列互补的ASODN，并用阳离子脂质体转染剂DOSPER介导，作用于人胃癌细胞系FGC85，空白组和正义寡脱氧核苷酸（SODN）作为对照，用以PCR为基础的端粒重复序列扩增法（TRAP）结合ELISA方法检测胃癌细胞的端粒酶活性，台盼蓝拒染法细胞计数，噻唑蓝（MTT）试验观察癌细胞增殖情况，免疫组化方法检测细胞增生抗原Ki-67。结果：脂质体介导的抗端粒酶ASODN对胃癌细胞的端粒酶活性具有抑制作用；细胞坟数和MTT试验显示胃癌细胞增殖速度明显减慢；细胞Ki-67染色阳性率显著降低。结论：特异性抗端粒酶ASODN可运用于抗肿瘤实验性治疗和相关研究。     

STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌放射治疗的增效作用

目的：评价STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌细胞A549增殖抑制作用及辐射增敏作用，探讨新的肺癌分子靶向治疗药物。方法：2003-10／2004-11于解放军第二军医大学放射医学教研室，应用阳离子脂质体介导STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549细胞，westem blot检测STAT3总蛋白和p—STAT3蛋白的表达；MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期；用克隆形成分析和SF2研究人肺腺癌细胞A549辐射敏感性的变化。结果：STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549后STAT3蛋白的表达和磷酸化水平下降，细胞增殖受抑制，出现Gl阻滞；照射后12d．反义寡核苷酸组测定SF2值是(46．78％&;#177;3．25％)．较对照组(61．52％&;#177;2．74％)明显降低(P&;lt;0．01)。结论：STAT3反义寡核苷酸可以抑制STAT3蛋白表达和细胞增殖，对人肺腺癌细胞A549有辐射增敏作用。     

STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌放射治疗的增效作用

目的:评价STAT3反义寡核苷酸对人肺腺癌细胞A549增殖抑制作用及辐射增敏作用,探讨新的肺癌分子靶向治疗药物。方法:2003-10/2004-11于解放军第二军医大学放射医学教研室,应用阳离子脂质体介导STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549细胞,westernblot检测STAT3总蛋白和p-STAT3蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖状态;流式细胞术检测细胞周期;用克隆形成分析和SF2研究人肺腺癌细胞A549辐射敏感性的变化。结果:STAT3反义寡核苷酸转染人肺腺癌A549后STAT3蛋白的表达和磷酸化水平下降,细胞增殖受抑制,出现G1阻滞;照射后12d,反义寡核苷酸组测定SF2值是(46.78%±3.25%),较对照组(61.52%±2.74%)明显降低(P<0.01)。结论:STAT3反义寡核苷酸可以抑制STAT3蛋白表达和细胞增殖,对人肺腺癌细胞A549有辐射增敏作用。     

干细胞生长因子反义寡核苷酸对肝癌细胞中原癌基因蛋白质c-kit及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的探讨干细胞生长因子(SCF)反义寡核苷酸对肝癌HepG2细胞中原癌基因蛋白质c-kit、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及意义。方法以脂质体作为转染载体,转染SCF反义寡核苷酸于HepG2细胞。实验分三组:(1)空白对照组;(2)转染SCF反义寡核苷酸组;(3)转染SCF错义寡核苷酸组。Western blot方法检测转染前后肝癌细胞中SCF、bFGF蛋白的表达,RT-PCR检测转染前后肝癌细胞中c-kit与bFGF mRNA的表达,用流式细胞仪检测转染SCF反义寡核苷酸后HepG2细胞凋亡率。结果与转染错义寡核苷酸组相比,SCF反义寡核苷酸对HepG2细胞中c-kit、bFGF的表达有明显抑制作用,转染SCF反义寡核苷酸可明显增加HepG2细胞凋亡率(P<0.01)。结论 SCF在肝癌细胞凋亡中有重要调节作用,SCF/c-kit有可能作为PI3K/Akt信号通路的上游对肝癌细胞bFGF的表达起重要调控作用。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞的影响

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对人胃癌细胞株的作用。方法：用端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸与人胃癌细胞株共同温育一定时间后，观察细胞形态变化，检测细胞DNA含量的分布，测定端粒酶活性。结果：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导人胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；电泳呈凋亡特征性Ladder带；流式细胞仪分析显示，在G1期前出现亚2倍体凋亡峰；端粒酶活性抑制。结论：端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸能诱导胃癌细胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端合成，从而抑制胃癌细胞的增殖。     

反义血管内皮生长因子对乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的　构建表达反义血管内皮生长因子165(VEGF165)的真核表达载体,观察其对人乳腺癌细胞MCF- 7的影响,探讨反义基因治疗乳腺癌的可行性。方法　应用基因重组技术,将人VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,将此表达载体转染人乳腺癌细胞MCF -7,观察转染前后MCF 7的VEGF165表达及细胞生长周期。结果　成功构建出VEGF165反义RNA真核表达载体,反义质粒转染后MCF -7细胞VEGF165表达下降,G1期细胞增加,S期细胞减少,细胞增殖能力降低。结论　VEGF165反义RNA能够明显减少人乳腺癌细胞株MCF- 7内VEGF165的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖,证明了反义基因干预治疗的有效性,为乳腺癌的基因治疗进行了有益探索。     

NOR1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响

目的NOR1基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）的构建并了解其对肝癌细胞系HepG2生长的影响。方法将NOR；cDNA亚克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达载体上，并把重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR，经脂质体转染至HepG2细胞中，运用MTT法、台盼蓝排斥等试验、流式细胞仪等分析NOR，基因对肝癌细胞HepG2生物学活性的影响。结果成功构建了NOR。基因真核表达体pcDNA3．1（＋）／NORl，经pcDNA3．1（＋）／NOR1转染后的HepG2细胞生长速度明显抑制（P〈0．05），且细胞从G0／G1期进入S期明显延缓。结论重组质粒pcDNA3．1（＋）／NOR1能在HepG2细胞内表达，且能影响HepG2细胞的生长。     

电化学治疗对人肝癌细胞SMMC7721化疗耐药性的影响

目的 观察电化学治疗对人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１化疗耐药性的影响,为其临床应用提供实验依据。方法 细胞计数法观察ＥＣＴ、化疗药阿霉素（ＡＤＲ）结合的抑癌效应,应用“多药效应分析软件”分析两之间的相互作用。流式细胞仪（ＦＣＭ）分析ＥＣＴ细胞内ＡＤＰ累积的影响,免疫组化法检测ＥＣＴ对ＳＭＭＣ７７２１细胞Ｐ－ｇｐ的影响,ＲＴ－ＰＣＲ法观察ＥＣＴ对细胞ＭＤＲ１ ｍＲＮＡ水平的影响。结果 ＥＣＴ与ＡＤＲ结     

Bcl-Xl基因反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的探讨BclXl基因反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞株EC9706增殖和凋亡的影响。方法用阳离子脂质体介导bclxL基因ASODN转染EC9706细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测EC9706细胞的增殖抑制率;逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹杂交检测BclXlmRNA和蛋白表达水平;吖啶橙荧光染色和流式细胞术定量检测EC9706细胞的凋亡率。结果MTT检测显示,BclXlASODN可显著抑制EC9706细胞的增殖(P<0.01),而且其对细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性;BclXlASODN对BclXlmRNA表达抑制率为57.29%。用吖啶橙荧光染色法和流式细胞检测ASODN组凋亡率(分别为31.13%±5.75%和30.5%,与细胞对照组、空白对照组及无关序列寡核苷酸组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论BclXl基因ASODN可有效抑制EC9706细胞的增殖,通过ASODN作用可下调BclXl基因表达,并显著促进EC9706细胞凋亡;BclXl基因有望成为食管癌基因治疗的新靶点。     

FH535抑制人肝癌细胞HepG2增殖及cyclin D表达

目的 探讨β-catenin抑制剂FH535对人肝癌细胞系HepG2增殖的影响及可能机制.方法 HepG2细胞分为对照组和FH535用药组,使用改良3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTS)检测FH535对HepG2细胞增殖的影响,以Western blot法检测HepG2细胞β-catenin以及cyclin D蛋白表达水平,用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测HepG2细胞cyclin D mRNA水平.结果 FH535能够显著抑制HepG2细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性.与对照组相比,FH535给药组HepG2细胞内β-catenin蛋白表达无差异.FH535给药组细胞wnt/β-catenin信号通路的靶基因cyclin D的mRNA和蛋白的表达显著下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.0001).结论 FH535通过抑制cyclin D mRNA及cyclin D蛋白表达而抑制HepG2细胞增殖.     

苦参碱对人结肠癌细胞株HT-29肝转移潜能的抑制作用

目的研究苦参碱对人结肠癌细胞株HT-29肝转移能力的影响,并探讨其机制。方法HT-29细胞体外培养,以0、0.125、0.25、0.5mg/ml不同浓度苦参碱进行预处理48h后,采用半定量RT-PCR检测各组培养细胞乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)mRNA表达的变化,应用细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变,Transwell小室检测体外侵袭能力的变化;建立结肠癌肝转移模型,腹腔内注射不同浓度的苦参碱,6周后,处死裸鼠,计数肝转移率和肝转移结节数。结果与对照组比较,随着苦参碱浓度的增加,各浓度苦参碱处理组HT-29细胞HPSE mRNA的表达和细胞黏附侵袭能力均受到明显的抑制(P<0.01),各组转移率及转移鼠肝转移结节数目依次下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论苦参碱可以抑制结肠癌肝转移,且抑制作用呈剂量依赖性。机制可能与通过下调HT-29细胞HPSE mRNA的表达进而使结肠癌细胞黏附侵袭力降低有关。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸(ASODN)对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC7901分为4组:空白对照组(Sham)、单纯脂质体对照组(Lip)、正义链转染对照组(Lip-SODN)、ASODN转染组(Lip-ASODN)。作用12、24、48 h后收获各组细胞。Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组(P<0.05);细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

聚乙二醇修饰后mdr—1基因的反义寡核苷酸对K562＼AO2细胞的作用

目的：探讨聚乙二醇对反义寡核苷酸的生物利用度的影响。方法：针对多耐药基因的反义寡聚脱氧核糖核苷酸靶向第二外显子跨越起始密码子ＡＵＧ的－６－９位点，在其５’端连接聚乙二醇的ＡＳ’的５’端连接聚乙二醇；在少１个碱基的ＡＳ’的５’端连接端连接二离。从ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ、ｐ１７０、细胞内柔红霉素浓度以及细胞对阿霉素的敏感性等各个水平上比较这几种反义寡核苷酸人耐药白血病系Ｋ５６２／ＡＯ２的作用，结果ＡＰ’能