Ad.mda-7/IL-24的构建及在卵巢癌耐药癌细胞株中的感染表达

目的 利用Adeasy 1系统,构建并鉴定人mda-7/IL-24重组腺病毒(Ad.mda-7/IL-24).方法 从质粒pREP4-mda-7中扩增目的基因mda-7/IL-24,亚克隆至pAdTrack CMV穿梭质粒中,与pAdEasy 1质粒在E.coli BJ5183中进行同源重组为腺病毒载体质粒,线形化后转染293细胞进行包装扩增得到Ad.mda-7/IL-24.感染人卵巢癌泰素耐药株OVCAR-8/TR,Western-blot检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达.结果 重组腺病毒载体经测序、酶切电泳及感染后蛋白表达检测均表明成功构建Ad.mda-7/IL-24;病毒感染量为10 μL时,感染OVCAR-8/TR细胞可达100%感染率.细胞感染后可表达MDA-7/IL-24目的蛋白.结论 成功构建了人Ad.mda-7/IL-24,并能有效感染卵巢癌耐药细胞株,为进一步研究mda-7/IL-24基因在卵巢癌耐药中的作用奠定了基础.     

人白细胞介素—2cDNA导入对卵巢癌耐药细胞株耐药性的逆转

为了构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并探讨白细胞介素－２（ＩＬ＿２）ｃＤＮＡ导入对顺铂诱民的卵巢癌耐药细胞株耐药性的影响。我们采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段，构建ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒。导入顺铂诱导的人卵巢癌耐药细胞株，观察其耐药性的改变。结果成功构建了ｐｃＤＮＡ－ＩＬ－２真核表达质粒，并在Ｃｏｓ－７细胞高效表达，导入卵巢癌耐药细胞后其对顺铂的敏感性显著升高。说明转导ｐｃ     

白藜芦醇对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP耐药逆转的初步研究

目的探讨白藜芦醇对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药逆转作用及其作用机制。方法体外培养人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP,以MTT法检测单用白藜芦醇对SKOV-3/DDP的杀伤影响,确定其对此细胞株的逆转剂量;同法测定无毒剂量白藜芦醇干预后SKOV3/DDP对顺铂耐药性的变化,通过流式细胞仪检测白藜芦醇逆转剂量干预细胞株后细胞的凋亡情况,采用RT-PCR方法检测白藜芦醇处理SKOV3/DDP细胞前后MDR-1和Bcl-2基因的表达。结果回归分析得出,当白藜芦醇终活性浓度<115.68 U/ml时,对SKOV-3/DDP细胞生长无明显抑制作用,其抑制率小于10%。DDP组于24、48、72 h作用耐药SKOV3/DDP细胞的IC50分别为（23.31±0.42）、（9.01±0.72）、（6.45±0.83）μg/ml,当与逆转剂量（100 U/ml）的白藜芦醇联合应用时白藜芦醇使DDP对耐药SKOV3/DDP细胞的IC50均降低,差异有统计学意义(（印）P（正）<0.05);与24 h RF值相比,48 h和72 h RF值差异均有统计学意义(（印）P（正）<0.05);与对照组相比,DDP组和白藜芦醇+DDP组人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡数、MDR-1 mRNA、Bcl-2 mRNA及MDR-1/Bcl-2值与对照组比较,组间差异均有统计学意义(（印）P（正）<0.05),且白藜芦醇+DDP组SKOV3/DDP细胞凋亡数、MDR-1/Bcl-2值明显高于DDP组(（印）P（正）<0.05)。结论白藜芦醇与卵巢癌发生、发展的密切相关,可有效逆转人卵巢癌SKOV3/DDP细胞的顺铂化疗耐药性,且可通过下调MDR-1和Bcl-2的mRNA表达以减少P-gp蛋白表达及药物外排,维持细胞内的DDP浓度。     

卵巢癌化疗耐药机制的研究进展

目前卵巢癌的临床治疗主要采用手术切除联合术后化疗,但绝大多数晚期患者会在5年内复发,或发展为化疗耐药,其5年生存率<50%,这已成为困扰妇产科医师的一大难题。卵巢癌化疗耐药的发生机制一直不能明确,为进一步治疗带来障碍,在此,我们将从细胞的膜、浆及核三方面对近期耐药机制     

抑癌基因mda-7/IL-24研究现状及进展

<正>在肿瘤治疗研究领域中,一个有效策略是发现并利用肿瘤细胞特异基因改变和(或)信号转导通路改变,从而能选择性地杀伤破坏肿瘤细胞,而对正常细胞和组织无毒副作用[1]。而一个理想的基因治疗要求该基因只在促进肿瘤细胞生长抑制和凋亡时,能     

hCG对人卵巢癌细胞株3AO体外生长和细胞周期的影响

目的 研究人绒毛膜促性腺激素（hCG）对卵巢癌细胞株3AO体外生长及2细胞周期的影响。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术（FCM），观察卵巢癌细胞株3AO在加入含不同浓度hCG培养液后细胞活性和生长周期的变化。结果 （1）浓度为0．1，1μg/ml的hCG可刺激3AO细胞株的生长，生长率分别增加到109％和121％；hCG浓度为10μg/ml时对细胞的生长几乎滑有影响，浓度为100μg/ml则抑制细胞生长。（2）hCG可使3AO细胞株G0/G1期细胞比例下降，G2／M期细胞比例增加，S期细胞变化不明显。结论 hCG在卵巢癌的发生和发展过程中有潜在的促进作用。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及耐药机制研究

目的：建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP,探讨其耐药的机制。方法：采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导卵巢癌细胞系COC1,建立卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP;CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）检测各种抗癌药对COC1和COC1／DDP细胞增殖的抑制作用,并计算耐药指数;GSH和GSSG试剂盒检测细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）的水平;高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量。结果：历时5个月建立COC1／DDP,对顺铂耐药性稳定,耐药指数为9．44;与COC1比较,COC1／DDP细胞内GSH的水平增高,顺铂含量下降（P〈0．01）。结论：入卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1／DDP耐药性稳定,耐药机制可能与GSH／GST-π解毒系统活性增强,减少细胞内顺铂含量有关。     

逆转录酶抑制剂对卵巢癌细胞株HO-8910细胞生长的影响

目的 探讨逆转录酶抑制剂（AZT）对卵巢癌细胞HO－8910生长的影响及其作用机制。方法 应用MTT分析法对不同浓度AZT作用的卵巢癌HO－8910细胞进行药物敏感实验,流式细胞仪测定凋亡细胞含量。结果 AZT对HO－8910细胞的生长有抑制作用,并有时间依赖关系和剂量依赖关系。流式细胞仪检测凋亡峰含量为14．2％。结论 AZT可能是通过诱导凋亡而抑制卵巢癌细胞的生长,因而在卵巢癌的治疗中有着巨大的潜力。     

mda-7/IL-24通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡

目的:观察mda-7/IL-24对不同类型的肝肿瘤细胞及正常肝脏细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的作用机制.方法:构建携带mda-7基因的重组腺病毒Ad-mda-7,转染肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和正常肝细胞L02,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况,Western印迹检测细胞相关蛋白的表达.应用钙蛋白酶抑制剂Ⅰ (ALLN,25 μmol/L)预处理上述细胞30 min,观察阻断内质网应激通路后上述指标的变化.结果:MTT法和流式细胞术检测结果表明,与感染Ad-GFP比较,Ad-mda-7选择性抑制肝癌细胞生长(P<0.01),诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01,其中对HepG2细胞影响最明显),而对正常肝细胞生长无明显影响;ALLN预处理能部分抑制Ad-mda-7的上述作用.Western印迹结果表明Ad-mda-7 能诱导HepG2细胞BiP/GRP78、Bax蛋白高表达(P<0.01),caspase-12、caspase-3活化及p38 MAPK磷酸化;ALLN预处理能抑制Ad-mda-7转染引起的Bax蛋白高表达及caspase-12、caspase-3活化;而对BiP/GRP78的高表达及p38 MAPK磷酸化无影响.结论:mda-7/IL-24可能通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡.     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的 通过建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对顺铂的耐药机制。方法应用顺铂连续作用并逐步提高药量的递增压力选择法，从人卵巢腺癌细胞ＣＯＣ１中分离出对顺铂耐药的细胞亚株（ＣＯＣ１／ＤＤＰ），并比较耐药细胞和亲代细胞某些生物学特性差异。结果ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性是ＣＯＣ１的６．５倍，群体倍增时间较亲代细胞缩短了１２．９％。对卡铂和丝裂霉素Ｃ有不同程度的交叉耐药性，对阿霉素和５－氟尿嘧啶则保持敏感。并且耐药细胞内铂离子含量及ＤＮＡ链间交联指数均明显低于ＣＯＣ１细胞，但免疫细胞化学显示ＣＯＣ１及ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞内均无Ｐ糖蛋白表达。结论ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度降低及ＤＮＡ链间交联形成减少，与Ｐ糖蛋白关系不大。     

MDA-7/IL-24对食管癌细胞的增殖和存活影响

目的：研究黑色瘤分化相关基因‐7（MDA‐7）／白细胞介素‐24（IL‐24）对食管癌细胞 Eca‐109与 TE‐1的增殖抑制作用和杀伤作用。方法应用RT‐PCR技术检测MDA‐7／IL‐24受体复合物在Eca‐109与 TE‐1细胞的表达,构建MDA‐7／IL‐24基因的重组腺病毒载体,将携带人MDA‐7／IL‐24基因的腺病毒Ad‐mda‐7分别感染食管癌细胞Eca‐109与TE‐1,通过Western‐blot检测MDA‐7基因的表达,通过CCK‐8检测该基因对食管癌细胞的增殖抑制作用,碘化丙啶（PI）染色后流式细胞仪检测MDA‐7对食管癌细胞周期的影响,Hoechst／PI双染色后流式细胞仪观察MDA‐7对食管癌细胞的诱导凋亡作用。结果 Eca‐109与 TE‐1均有表达MDA‐7／IL‐24受体复合物IL‐22R1／IL‐20R2;成功构建包装重组腺病毒,并经 Western‐blot验证其介导了外源基因 MDA‐7／IL‐24在Eca‐109与TE‐1细胞中的高效表达;CCK‐8实验结果表明,MDA‐7／IL‐24能显著抑制Eca‐109与 TE‐1细胞的增殖,且随着感染时间的延长及感染剂量的增加而增强抑制作用;细胞周期结果提示,MDA‐7／IL‐24使大量Eca‐109与TE‐1细胞被阻滞在G1～G0期;Hoechst／PI双染色结果提示,MDA‐7／IL‐24能明显促进Eca‐109与TE‐1细胞的凋亡。结论重组腺病毒能介导MDA‐7／IL‐24基因通过G1期阻滞和诱导凋亡,从而抑制食管癌细胞的增殖。     

Drosha基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达研究

目的 探讨Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药的关系.方法 分别采用实时定量PCR和免疫印迹法检测Drosha基因mRNA及其蛋白在A2780/DDP及A2780细胞中表达的差异.结果 A2780/DDP细胞中Drosha基因mRNA及其蛋白的表达量分别是A2780细胞表达量的(56.79±1.65)%和(50.16±1.34)%,两者比较差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 Drosha基因在A2780/DDP细胞中明显下调,提示Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药相关.     

人卵巢癌顺铂耐药细胞EZH2基因沉默对Drosha基因表达的影响

目的探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响。方法获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达。结果以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%。结论沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。     

miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达及其意义

目的分析miR-130a在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达,探讨miR-130a与卵巢癌对顺铂耐药的关系。方法以浓度梯度递增法构建卵巢癌耐顺铂细胞株,MTT法对耐药细胞株进行鉴定并测定耐药指数,应用荧光实时定量PCR检测并分析各细胞株中miR-130a的表达。结果成功构建卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/CIS1、A2780/CIS2和SKOV3/CIS(P<0.05),其耐药指数分别为30.2、5.3和24.5。荧光实时定量PCR结果显示miR-130a在卵巢癌耐药细胞株中存在稳定的异常高表达(P<0.05),A2780/CIS1、A2780/CIS2以及SKOV3/CIS中miR-130a表达分别较亲本细胞平均上调30.51倍、4.87倍和24.43倍。各耐药细胞中miR-130a表达上调倍数接近于各自的顺铂耐药指数。结论 miR-130a表达的上调可能与卵巢癌细胞株对顺铂的耐药性密切相关。推测抑制miR-130a的表达有助于逆转卵巢癌顺铂耐药性,miR-130a有望成为逆转卵巢癌顺铂耐药性的潜在基因治疗靶点。     

热疗联合三代铂类药物对卵巢癌细胞株SKOV3的影响

目的 探讨热疗分别联合三代铂类药物即顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、奥沙利铂（OXA）对卵巢癌细胞株SKOV3增殖的影响及其可能机制。方法 SKOV3细胞采用热疗（42 ℃）或常温（37 ℃）联合不同浓度的DDP（终浓度分别为0、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL）、CBP及OXA（终浓度均为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL）处理, MTT法检测对SKOV3细胞增殖的影响,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测SKOV3细胞经相应处理后核苷酸切除修复交叉互补组基因(excision repair cross-complementing group 1, ERCC1)、凋亡抑制基因（Survivin）的表达变化。结果 DDP、CBP、OXA对卵巢癌细胞株SKOV3的增殖呈抑制作用,并呈剂量依赖性（P<0.05）,42 ℃热疗能增强铂类药物对SKOV3细胞株的增殖抑制作用; DDP、CBP、OXA对卵巢癌细胞株增殖的半数抑制浓度（IC50）分别为（7.271±0.096） μg/mL、（37.609±0.779）μg/mL、（28.328±0.698） μg/mL,42 ℃热疗联合上述铂类药物后IC50分别为（2.075±0.244） μg/mL、（19.591±0.453） μg/mL、（19.089±0.424） μg/mL,增敏倍数分别为2.075±0.244、1.92±0.044、1.484±0.039（P<0.05）,其中对DDP的增敏效果最显著;在三代铂类药物中,热疗均能下调ERCC1 mRNA的表达（P<0.05）,且CBP下调最显著;热疗联合CBP、OXA作用于SKOV3时均能下调Survivin mRNA的表达（P<0.05）,其中OXA组更显著,但DDP联合热疗对Survivin mRNA表达的影响差异无统计学意义（P>0.05）。结论 热疗联合三代铂类药物能增强铂类药物对SKOV3细胞的增殖抑制作用,增加肿瘤细胞对铂类药物的敏感性,其增敏机制可能与下调ERCC1 mRNA和Survivin mRNA表达有关。     

理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性的影响及其作用机制研究

背景　本课题组前期对理冲生髓饮有效组分进行了抗卵巢癌的研究,结果表明中药复方可以抑制卵巢癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡,减少癌细胞黏附,抑制血管新生,由此提出理冲生髓饮有效组分可以逆转卵巢癌干细胞耐药这一假说。目的　探讨理冲生髓饮有效组分对卵巢癌干细胞调控相关基因及顺铂耐药性影响及其作用机制。方法　2017年10月—2018年4月,选取BALB/C裸鼠48只,构建卵巢癌SKOV3荷瘤鼠模型,将裸鼠分为空白组（给予0.9%氯化钠溶液,12只）、顺铂组（给予顺铂,12只）、中药组（给予理冲生髓饮有效组分混合物,12只）、中药+顺铂组（除给予理冲生髓饮有效组分混合物外同时给予顺铂,12只）。于造模第8天开始给药,共给药18 d。最终空白组死亡4只裸鼠,顺铂组死亡3只裸鼠,中药组死亡1只裸鼠,中药+顺铂组死亡1只裸鼠。绘制各组肿瘤生长曲线。给药结束后处死裸鼠,制备肿瘤组织,HE染色观察肿瘤病理学特征,免疫荧光染色观察肿瘤CD44+、CD117+、CD44、CD117、CD133细胞情况,PCR检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1 mRNA表达水平,免疫组化法检测肿瘤Nanog、Oct4、ABCC1表达水平。结果　各组在给药第1~7天肿瘤生长速度均逐渐增快;在给药第7~10天中药组和中药+顺铂组肿瘤生长速度明显变慢,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度较快;中药组和中药+顺铂组肿瘤在第13天生长体积达到高峰,之后逐渐下降,而空白组和顺铂组肿瘤生长速度仍逐渐增快。顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,体积缩小,核分裂象可见,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生;中药组肿瘤细胞数目减少,肿瘤组织呈较明显的片状坏死,间质中纤维组织和纤维细胞增生;中药+顺铂组肿瘤细胞数目明显减少,可见大量肿瘤细胞凋亡,间质纤维组织明显增生。肿瘤中可见少量CD44+、CD117+、CD133、CD44、CD117细胞。顺铂组、中药组、中药+顺铂组肿瘤Nanog、Oct4 mRNA表达水平高于空白组（P<0.05）;中药组肿瘤Nanog mRNA表达水平高于顺铂组、中药+顺铂组（P<0.05）;中药+顺铂组肿瘤ABCC1 mRNA表达水平低于空白组、顺铂组、中药组（P<0.05）。顺铂组、中药+顺铂组肿瘤Nanog表达水平低于空白组（P<0.05）;中药组肿瘤Oct4表达水平低于空白组、顺铂组（P<0.05）;中药组、中药+顺铂组肿瘤ABCC1表达水平低于空白组、顺铂组（P<0.05）。结论　理冲生髓饮有效组分可通过下调ABCC1及其mRNA表达水平,增高肿瘤细胞中药物浓度,还可通过影响卵巢癌干细胞特性和顺铂敏感性,从而逆转卵巢癌对顺铂的耐药性。     

肾癌mda-7/IL-24基因mRNA表达与浸润转移的关系

目的 为探讨mda-7／IL-24mRNA在肾癌组织中的表达状况。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应法(RT -PCR)检测30例肾癌及其癌周组织mda-7／IL-24mRNA的表达情况。结果 肾癌组织中的mda-7／IL-24mRNA表 达率(13／30,43．3％)较癌周组织的表达率(30／30,100％)低(P<0．01);Ⅰ、Ⅱ期癌mda-7／IL-24mRNA阳性表达率 (11／19,57．8％)高于Ⅲ、Ⅳ期癌中的表达率(2／11,18．2％)(P<0．05);Ⅰ、Ⅱ期肾癌组织的mda-7／IL-24mRNA表 达量[积分光密度比值riOD为(33．61±6．21)％,n=11]较正常癌周组织的表达量[riOD为(38．42±6．91)％,n= 30]少(P<0．01),而Ⅲ、Ⅳ期癌中的表达量[riOD为(15．04±6．25)％,n=2]更少。结论 mda-7／IL-24mRNA的表 达下调与肾癌的局部发展和转移密切相关,可作为判断肾癌生物学行为的指标之一。     

非诺贝特对体外卵巢癌细胞SKOV3生长及迁移的作用

目的 初步了解过氧化物酶增殖物激活受体α（PPARs)激动剂非诺贝特对卵巢癌细胞生长情况的影响。方法 选用人卵巢癌SKOV3细胞株作为研究对象,选择不同浓度的非诺贝特进行培养,设置对照组（不含非诺贝特）,采用MTT法测定不同浓度非诺贝特对体外卵巢癌SKOV3细胞系细胞增殖抑制作用;荧光显微镜观察Hoechst/碘化丙啶(PI)及Annexin-Ⅴ/PI染色后非诺贝特诱导SKOV3细胞凋亡作用;细胞划痕实验观察非诺贝特作用后SKOV3细胞的迁移改变。结果 ①MTT实验中发现,与对照组相比,10、25、50、75、100 μmol/L非诺贝特处理体外卵巢癌SKOV3细胞24、48、72 h后,各浓度对SKOV3细胞均产生抑制作用（P<0.05）。并随浓度增加,抑制效果增强,24、48、72 h 100 μmol/L抑制率最高（P<0.05),分别为55.72%±0.28%、57.63%±0.47%、72.41%±0.62%（P<0.05）。②Hoechst/PI和Annexin-Ⅴ/PI荧光染色置荧光显微镜下检测示,10、25、50、75、100 μmol/L非诺贝特处理细胞24 h后,诱导细胞凋亡,随着非诺贝特药物浓度的增加,SKOV3细胞凋亡越明显。③划痕损伤实验结果显示,与对照组相比,在10、25、50、75、100 μmol/L非诺贝特作用于SKOV3细胞24 h后,细胞迁移距离缩短（P<0.05）。结论 非诺贝特对体外人卵巢癌SKOV3细胞的增殖及细胞迁移均有抑制作用,并一定程度上诱导细胞凋亡。