内源性一氧化碳对培养的肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的调节

目的 探讨内源性一氧化碳（CO）对低氧性肺血管平滑肌细胞（PASMC）增殖与凋亡的影响及机制。方法 体外培养Wistar大鼠PASMC,进行低氧并予以血红素氧合酶抑制剂卟啉锌－9（zinc protoporphyrin IX,ZnPP-9)处理,分为常氧12h组（N1组）、常氧24h组（N2组）、低氧12h组（H1组）、低氧24h组（H2组）、低氧12h ZnPP组（H1＋ZnPP组）、低氧24h ZnPP组（H2＋ZnPP组）,采用流式细胞术、免疫细胞化学方法检测PASMC增殖与凋亡情况。结果 1．碳氧血红蛋白（HbCO)检测：采用双波长法测定细胞培养液中HbCO的吸光度,用以代替培养液中CO的相对含量。低氧12h培养液中HbCO较常氧时显著增高（P＜0．01）,至24h恢复至常氧水平（P＞0．05）;而低氧同时进行干预,H1＋ZnPP及H2＋ZnPP两组HbCO水平均下降,且明显低于单纯低氧组（P＜0．01）,两组与常氧组相比亦有差异（P＜0．001）。2．流式细胞仪检测PASMC增殖指数（PI）与凋亡指数（AI）：H1组PI较N1组下降（P＜0．01）,H2组则较N2组增高（P＜0．001）;H1＋ZnPP组较H1组PI显著增高（P＜0．001）,H2＋ZnPP组与H2组比则无明显变化（P＞0．05）;H1组AI低于H2组（P＜0．01）,H1＋ZnPP组AI高于H1组（P＜0．001）,H2＋ZnPP组则低于H2组（P＜0．001）。3．PCNA免疫细胞化学染色,H1组及H2组PASMC细胞核阳性反应颗粒分别按N1及N2组明显增加（P分别＜0．01及P＜0．001）,H1＋ZnPP组及H2＋ZnPP组分别较H1及H2组增强（P＜0．01）。4．Caspase 3免疫细胞化学：H2组与H1组比胞浆着色增强（P＜0．05）,ZnPP处理12h及24h分别较H1及H2减弱（P＜0．05）。5．NF－κK免疫细胞化学：H1及H2组核染色分别较N1及N2组增强（P＜0．001）,而H1＋ZnPP组及H2＋ZnPP组则又分别较H1、H2组阳性核表达增多（P＜0．01）。结论 1．低氧12h内源性CO对PASMC增殖抑制作用显著,对凋亡可能无直接影响;低氧24h CO促进PASMC凋亡作用明显,而对增殖的影响不显著。2．NF－κB可能参与了内源性CO抑制PASMC增殖的调控机制。     

一氧化碳对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨一氧化碳（CO）对缺氧性大鼠肺血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法 将大鼠随机分为4组：常氧对照组（7只）、低氧组（6只）、低氧＋锌原卟啉组（低氧＋ZnPP组）（6只）及低氧＋低浓度一氧化碳组（低氧＋低浓度CO组）（5只）。应用增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体、Fas多克隆抗体经免疫组织化学检测技术及原位缺口末端标记法（TUNEL）对大鼠肺动脉平滑肌细胞进行增殖与凋亡定位及半定量分析。结果 1．低氧＋低浓度CO组肺动脉平滑肌细胞增殖指数（PI）明显低于低氧组和低氧＋ZnPP组（P＜0．01）,低氧＋ZnPP组PI高于低氧组（P＜0．01）;2．TUNEL检测低氧＋低浓度CO组凋亡指数（AI）明显高于其余三组（P＜0．01）;3．低氧＋低浓度CO组Fas表达高于其余三组（P＜0．01）;4．低氧＋低浓度CO组PI／AI与常氧对照组PI／AI相近约等于1。结论 CO对缺氧大鼠肺血管平滑肌细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

内源性一氧化碳对肺动脉平滑肌细胞增殖基因表达谱的影响

目的 运用芯片技术研究内源性一氧化碳（CO）刺激下血管平滑肌细胞内增殖相关基凼表达谮的变化。方法 取SD大鼠肺动脉平滑肌细胞进行离体培养,用血小板源性生长因子（PDGF,20ng／m1）和Hemin（20μmol／L）进行刺激后,用Affymetrix表达基因谱芯片检测其基因表达谱变化。结果 Hemin刺激与PDGF刺激相比差异表达基因366条,与增殖相关的差异表达基因21条,上调11条,下调10条。其中原来在PDGF刺激下上调表达的一些基因（Map2k3、cyclinD1、PDGFA、mybL1、a．nape10、MMP14等）在经内源性CO刺激后其表达则显著下调。结论 内源性CO很可能是通过作用于MAPK途径来抑制PDGF的促增殖功能,同时伴有cyclinD1、cyclinG1、P21等的参与。     

米贝地尔对血小板衍生生长因子诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨新型钙通道拮抗剂米贝地尔(mibefradil,Mib)对血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖的影响。方法体外培养HPASMCs,随机分为对照组、PDGF刺激组、Mib干预组、PDGF+Mib组,PDGF刺激组细胞用25 ng/ml PDGF刺激,Mib干预组细胞加入10μmol/L的Mib干预,PDGF+Mib组细胞予PDGF和Mib联合干预。通过MTT法检测48 h和72 h各组HPASMCs增殖率,流式细胞术检测细胞周期,免疫荧光染色法观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果 MTT法检测48 h和72 h各组HPASMCs增殖率的差异均具有统计学意义(P0.05),并以72 h时的差异更明显;其中PDGF组均为最高,与其余3组间的差异均有统计学意义(P均0.05);而PDGF+Mib组与Mib组、对照组,以及Mib组与对照组间的差异则无统计学意义(P0.05)。流式细胞术检测各组G0/G1期及S期细胞比例差异均有统计学意义(P0.05);其中PDGF刺激组G0/G1期细胞比例最低、S期细胞比例最高,与其余3组比较差异均有统计学意义(P0.05);PDGF+Mib组与Mib组、对照组,以及Mib组与对照组间的差异均无统计学意义(P0.05)。免疫组化染色结果表明各组间PCNA表达差异有统计学意义(P0.05);其中PDGF组的PCNA表达最高,与其余3组间的差异均有统计学意义(P均0.05);而PDGF+Mib组与Mib组、对照组,以及Mib组与对照组间的差异则无统计学意义(P0.05)。结论 Mib组能显著抑制PDGF诱导的HPASMC增殖,抑制PDGF促进的细胞周期进程,对PCNA的表达具有明显的抑制作用。     

内源性一氧化碳在神经系统中的作用

由血红素氧化酶降血红素产生的内源性一氧化碳（CO）能够活化细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶，传递神经元信息、舒张血管平滑肌、抑制血小板聚集。可能在长期增效、嗅神经发育和功能、伤害感受信号传递、发热反应等过程中具有重要作用。在缺氧缺血性脑损害中，CO可能对神经细胞既有保护作用又具有毒性。     

内源性一氧化碳在神经系统中的作用

由血红素氧化酶降解血红素产生的内源性一氧化碳（ＣＯ）能够活化细胞内的可溶性鸟苷酸环化酶,传递神经元信息、舒张血管平滑肌、抑制血小板聚集。可能在长期增效、嗅神经发育和功能、伤害感受信号传递、发热反应等过程中具有重要作用。在缺氧缺血性脑损害中,ＣＯ可能对神经细胞既有保护作用又具有毒性。     

内源性一氧化碳/血红素氧合酶体系在缺氧性肺动脉高压形成中的作用

目的 研究内源性一氧化碳／血红素氧合酶（CO／HO）体系在慢性低氧环境中的变化规律，探讨CO／HO体系在缺氧性肺动脉高压形成中的作用。方法 将第1批大鼠随机分为对照组、低氧1d组、低氧3d组、低氧7d组、低氧14d组；第2批大鼠随机分为对照组、低氧组、低氧＋锌原卟啉（ZnPP）均。均以右心导管法测定肺动脉压力；称量并计算右心室与左心室加室间隔的比例；应用双波长分光光度法间接测定大鼠血浆及肺组织匀浆中CO含量；应用免疫组织化学技术对第一批大鼠肺内HO－1蛋白表达进行定位及半定量分析。结果 大鼠低氧7－14d开始形成稳定的肺动脉高压，伴右心室肥大；血浆及肺组织心浆中CO含量分别于低氧1d和低氧14d时两次明显增高（P＜0．01）；低氧1－3d肺泡及肺泡间质巨噬细胞和炎性细胞（F＝8．72，P＜0．001）；低氧＋ZnPP组大鼠肺动脉平均压明显高于对照组及低氧组，血浆及肺组织匀浆中CO含量明显 于氏氧组（P均＜0．01）。结论 内源性CO／HO体系在慢性低氧刺激下明显增高，且呈时间依赖性的双峰现象，其中第2次代偿性增高与肺动脉压力的变化密切相关，HO－1抑制剂的干预研究进一步表明，内源性CO／HO体系对缺氧性肺动脉高压形成具有积极的调节作用。     

一氧化碳下调高血压大鼠血管平滑肌细胞硫化氢体系

目的研究一氧化碳(CO)对自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMC)中硫化氢(H2S)/胱硫醚γ裂解酶(CSE)的影响。方法SHRVSMC分为氯化血红素(hemin)实验组和hemin对照组,硫电极法测定培养上清中H2S含量,竞争性RTPCR法检测细胞中CSEmRNA水平。结果实验组较对照组培养上清中H2S含量显著降低[(16.03±2.15)μmol/Lvs(13.31±1.74)μmol/L],CSEmRNA水平较对照组降低[(0.17±0.04)vs(0.13±0.03)]。结论CO可下调SHR的VSMC中H2S/CSE体系。     

内源性一氧化碳对肺动脉平滑肌细胞凋亡基因表达谱的影响

目的：运用芯片技术研究内源性一氧化碳(CO)刺激下血管平滑肌细胞凋亡相关基因表达谱的变化。方法：取Sprague-Dawley (SD)大鼠肺动脉平滑肌细胞进行离体培养,用血小板源性生长因子BB(platelet-derived growth factor,PDGF-BB, 20 ng/mL)和高氯血红素(hemin, 20 μg/mL）进行刺激后2 h,用Affymetrix表达基因谱芯片检测其基因表达谱变化。结果：PDGF刺激后,Map2k3(P38)信号通路中相关差异表达基因Kras、Nras、丝分裂原蛋白激酶的激酶Map2k3 、细胞周期素CyclinD1、CyclinH、CyclinL1等的表达显著上调,而周期素依赖性蛋白激酶抑制因子P27的表达显著下调。Hemin刺激后,P53依赖途径中的一些基因如:Gadd45α、P21、Trp53inp1表达显著上调。结论内源性CO所引发的血管平滑肌细胞的凋亡可能与P53调控途径密切相关。［中国当代儿科杂志,2010,12(11)：882-885］     

核转录因子-κB在辛伐他汀抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)在辛伐他汀抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖中的作用。方法随机将体外培养的大鼠PASMC分为对照组、血小板源性生长因子(PDGF)刺激组、辛伐他汀干预组和辛伐他汀联合小白菊内酯(NF-κB抑制剂)干预组,每组6个样本。通过MTT比色法和流式细胞术检测PASMC的增殖及细胞周期;通过免疫组织化学检测NF-κB蛋白的表达并进行图像分析;通过RealTime PCR检测NF-κB m RNA的表达水平。结果 PDGF刺激组的各时间点MTT值,S期和G2+M期细胞比例,NF-κB蛋白及mRNA表达水平均较对照组显著升高(均P0.05);给予辛伐他汀干预后,上述各指标水平均较PDGF刺激组降低(均P0.05);辛伐他丁联合小白菊内酯干预后上述各指标下降更加明显,但与辛伐他汀干预组比较差异均无统计学意义(均P0.05)。结论辛伐他汀能抑制PASMC的增殖和细胞周期进程;NF-κB可能在辛伐他汀对PASMC增殖的抑制中起重要作用。     

GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织表达及地塞米松对其抑制作用

目的探讨转录因子GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织中表达及地塞米松（Dex）对其干预作用。方法采用卵清蛋白（OVA）致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型;Balb/c小鼠24只随机分为对照组、哮喘组、Dex治疗组各8只。采用免疫组织化学方法检测肺组织GATA-3蛋白表达;反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肺组织GATA-3 mRNA相对水平;流式细胞技术检测小鼠脾CD4 T细胞白细胞介素-4（IL-4）水平;HE染色评价各组小鼠气管炎性反应变化。结果哮喘组小鼠肺组织GATA-3及mRNA水平、IL-4水平均明显高于对照组（P〈0.05）,Dex治疗组GATA-3阳性细胞数及mRNA水平、IL-4水平均明显低于哮喘组,具有显著性差异（P〈0.05）。HE染色结果表明Dex治疗组气管炎性反应明显缓解。结论GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织呈高表达。Dex可阻断哮喘鼠肺组织GATA-3表达,抑制Th2型细胞因子释放,减轻气管炎性反应。     

转录因子GATA-3 圈套核苷酸抑制哮喘小鼠呼吸道炎性反应的实验研究

目的 探讨转录因子GATA-3在支气管哮喘小鼠发病机制中的作用及 GATA-3圈套核苷酸治疗支气管哮喘的可行性.方法BALB/c小鼠32只,随机分为4组:正常对照组、哮喘模型组、GATA-3圈套核苷酸治疗组(ODN组)和突变圈套核苷酸治疗组(mODN组),每组8只.采用鸡卵白蛋白致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型;通过呼吸道给药的方式,将GATA-3圈套核苷酸及突变GATA-3圈套核苷酸转染至哮喘小鼠肺部.应用免疫组织化学染色检测其GATA-3蛋白的表达,应用反转录聚合酶链反应检测小鼠肺组织IL-5、IL-13 mRNA表达;收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),进行细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)计数,HE染色评价肺组织病理变化.结果哮喘模型组小鼠肺组织GATA-3蛋白表达水平、肺组织IL-5、13 mRNA表达水平、BALF细胞总数及EOS计数均明显高于正常对照组(Pa<0.01);ODN组小鼠肺组织IL-5、13 mRNA表达水平均明显低于哮喘模型组(Pa<0.01),BALF中细胞总数及EOS计数亦均较哮喘模型组显著减少(Pa<0.01),HE染色显示ODN组小鼠肺血管周围和支气管周围炎性反应明显减轻;而mODN组小鼠与哮喘模型组比较,上述指标均无明显变化.结论GATA-3高表达在小鼠哮喘模型效应阶段呼吸道炎性反应中具有重要作用,GATA-3圈套核苷酸通过特异性阻断GATA-3活性,有效抑制Th2型细胞因子的产生,从而减轻哮喘小鼠呼吸道炎性反应.GATA-3 圈套核苷酸可作为一种新的方法治疗哮喘及其他以Th2型免疫反应为主的变应性疾病.     

硫化氢体系在大鼠低氧性肺动脉平滑肌细胞增殖中的意义

目的　探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞中胱硫醚 γ 裂解酶 (CSE)基因表达的影响和硫化氢对肺动脉平滑肌细胞增殖的调节作用。方法　人工培养大鼠的肺动脉平滑肌细胞 ,实验分为 1.对照组 ;2 .硫氢化钠 (NaHS)组 :10 - 4mol/LNaHS处理 2 4h ;3 .低氧组 :氧浓度 1%以下 2 4h ;4.低氧 NaHS组 :低氧 2 4h ,10 - 4mol/LNaHS。每组各 6孔细胞。用3H TdR掺入估计细胞增殖 ,用定量竞争性RT PCR方法测定CSEmRNA含量 ,评价CSE基因表达。结果　低氧组平滑肌细胞中的CSEmRNA含量较对照组减少 67% (P <0 .0 1)。低氧组细胞的3H TdR掺入较对照组增加 66% (P <0 .0 1) ;NaHS组细胞的3H TdR掺入较对照组减少 3 7%(P <0 .0 1) ;低氧 NaHS组的3H TdR掺入较低氧组减少 2 9% (P <0 .0 1)。结论　低氧使人工培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞中CSE基因表达下调 ,硫化氢对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖有抑制作用。     

一氧化氮对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞硫化氢/胱硫醚-γ-裂解酶的调节作用

目的研究一氧化氮(NO)对自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞硫化氢(H2S)/胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的调节作用。方法大鼠主动脉平滑肌细胞分为硝普钠(SNP)实验组和对照组,硫电极法测定培养上清中H2S含量,竞争性RT-PCR法检测细胞中CSE mRNA水平。结果SNP实验组较对照组培养上清H2S含量显著升高[(16.16±3.71)μmol/Lvs(22.71±4.84)μmol/L],但CSE mRNA的水平在SNP组较对照组明显降低[(0.16±0.06)vs(0.12±0.04)]。结论SNP对SHR血管平滑肌细胞中H2S/CSE体系发挥复杂的调节作用。     

重组人白细胞介素6对SW872脂肪细胞增殖和凋亡的影响

目的　探讨白细胞介素 6(IL 6)对SW872脂肪细胞增殖及凋亡的影响。方法　体外培养SW872脂肪细胞 ,0 .6mmol/L油酸诱导SW872前脂肪细胞分化 ,化学比色法检测细胞内三酰甘油的总量 ;油红O染色观察细胞内脂肪的聚积 ;MTT法检测不同浓度IL 6对SW872前脂肪细胞增殖活力的影响 ;流式细胞仪分析IL 6对SW872成熟脂肪细胞凋亡的影响。结果　 0 .6mmol/L油酸刺激 72h ,几乎 10 0 %SW872前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞 ,细胞内三酰甘油的含量明显增加 ,油红O染色胞浆内可见丰富的脂滴 ;5 μg/LIL 6对SW872前脂肪细胞的增殖没有影响 ,10～ 5 0 μg/LIL 6明显抑制SW872前脂肪细胞的增殖 ;IL 6对SW872成熟脂肪细胞的凋亡无影响。结论　IL 6能明显抑制SW872前脂肪细胞的增殖 ,其抑制效应呈剂量依赖性 ,表明IL 6可能与肥胖有关 ,高剂量IL 6可降低肥胖的程度。     

造血干细胞分化过程中HOXB6基因表达及干预研究

目的探讨脐血造血干细胞(HSC)向粒-单系(CFU-GM)、红系(CFU-E)和淋巴系祖细胞(CFU-TL)增殖分化过程中HOXB6基因的表达情况及全反式维A酸(ATRA)对其的影响。方法1.采用造血干/祖细胞体外培养技术,以ATRA持续干扰人类脐血造血干/祖细胞,观察HSC经人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)和植物血凝素(PHA)分别诱导后,在培养第3天、第7天和第12天的CFU-GM、CFU-E及CFU-TL集落生成情况。2.采用实时荧光定量RT-PCR技术(FQ-RT-PCR)检测造血干细胞增殖分化过程中HOXB6基因的表达水平。结果1.人类造血干细胞向CFU-GM、CFU-E和CFU-TL增殖分化过程中,各组细胞HOXB6基因均有表达。2.随时间推移,CFU-GMHOXB6 mRNA在增殖分化的第3天开始表达,第7天表达最强烈,第12天表达明显减弱;CFU-E HOXB6 mRNA表达在第3天、第7天和第12天均持续增强;而在CFU-TL中,HOXB6 mRNA表达在第7天最强烈,第12天表达减弱。3.与对照组比较,ATRA可上调各组HOXB6基因的表达。结论1....     

血管内皮细胞定量测定在小儿血管畸形和血管瘤细胞增殖凋亡中的意义

目的探讨小儿血管畸形和血管瘤增殖凋亡及血管内皮细胞数的区别。方法共收集真性血管瘤标本37例,根据Mulliken标准分成血管瘤增生组和退化组;血管畸形14例,将标本分成血管瘤增生组和退化组。14例血管畸形标本制成单细胞悬液,加入DNA-PREPTMMLPR液和PI液后,流式细胞仪分析细胞周期,得各期细胞数S%,G2/M%及增殖指数(PI);单细胞悬液标记CD34-FITC/CD31-PE/7-AAD试剂,测定血管内皮细胞数;用AnnxinV和7-AAD双染测定早期凋亡细胞数。结果血管瘤增生组和退化组S%的细胞分别是5.99±1.85、1.92±0.65;G2/M%的细胞分别是7.46±1.82、5.94±1.63;PI分别是13.49±2.08、7.85±1.78,增生期的PI明显高于退化期(P<0.01);AV %分别是9.84±3.05、16.18±4.89。血管畸形的PI、S%分别是8.39±0.89、2.17±1.18,均比增生组低(P<0.05),与退化组比较,差异无统计学意义,G2/M%为6.23±1.64,与血管瘤的增生退化组比较均无明显差异,血管畸形AV %为12.91±4.1,高于血管瘤增生组(P<0.05),与退化组比较差异无统计学意义,细胞增生组和退化组的CD34 %各是0.915±0.33、0.36±0.12,血管畸形CD34 %为0.52±0.14,增生组较其他两组高(P<0.05),而血管畸形与退化组间差异无统计学意义。CD31 %增生组、退化组、血管畸形各是7.77±2.48、5.29±1.72、5.775±1.52,三者间差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论流式细胞术测定PI,S%,AV %及CD34 %可以区别增生期血管瘤和血管畸形,对指导临床治疗有一定意义。     

骨髓间充质干细胞移植对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对野百合碱诱导的肺动脉高压(PAH)大鼠肺血管重构的影响.方法 体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs.健康雄性SD大鼠随机分为3组:正常对照组(n＝15)、PAH组(n＝20)和MSCs移植组(n＝20).PAH组和MSCs移植组大鼠一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg·kg -1),复制PAH肺血管重建动物模型.3组大鼠在同等条件下饲养.3周后,MSCs移植组大鼠经舌下静脉注射5×109 L-1的经Hoechst 33342标记的MSCs细胞悬液1 mL,PAH组大鼠予等量低糖-Dulbecco改良Eagle's培养液(L-DMEM)注射,正常对照组不做任何处理.移植28 d,观察3组大鼠肺小动脉的显微结构及超微结构的改变.结果 PAH大鼠用MSCs移植28 d后,肺小动脉管壁厚度指标(WD/TD％、VA％)、放射性肺泡计数、肺非肌性小动脉肌化程度均较PAH组显著改善(P＜0.01);其肺小动脉的重构及超微结构的血气屏障、线粒体、板层小体等改变均有明显改善.荧光显微镜观察到Hoechst 33342标记的MSCs在肺内定植,且分化成大量新生血管并形成侧支循环,肺动脉重构得到有效逆转.结论 MSCs移植可有效减轻并逆转肺动脉重构的进程,其作用机制是MSCs分化形成新生血管,建立了侧支循环,从而修复野百合碱诱导的肺损伤.