腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达

目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.     

腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子基因感染NIH3T3细胞的实验研究

目的:探讨腺病毒介导人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)基因感染NIH3T3细胞后目的基因表达情况及其对细胞增殖分化的影响,并观察体内移植后的表达情况及其血管生成效应.方法:构建含hVEGF基因重组腺病毒Ad.hVEGF,体外感染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效果和转染率,采用免疫组化、RT-PCR和ELISA法分别检测转染后的NIH3T3细胞VEGF的表达情况.将转染后的NIH3T3细胞移植于小鼠背部皮肤缺损模型上,1周后取创面覆盖的脱细胞真皮组织标本,免疫组化检测组织VEGF的表达,并行组织新生血管计数.结果:携带hVEGF基因的重组腺病毒对于NIH3T3细胞具有较高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicities of infection,MOI)具有量效关系.MOI为100倍时,转染效率达95%.RT-PCR和免疫组化检测到,Ad.hVEGF感染NIH3T3细胞24 h后即可在基因和蛋白质水平表达,ELISA法检测到VEGF第3日表达分泌较高,7 d时达到表达高峰(1052 pg/ml),13 d后仍可检测到VEGF的表达.2周内MTT法动态检测D值,转染组细胞与未转染组细胞比较无显著性差异(P＞0.05).转染细胞体内种植后在组织中亦可明显表达VEGF,实验组新生血管数显著高于对照组(P＜0.01).结论:腺病毒介导的VEGF基因可有效转染NIH3T3细胞,体内外均可有效表达目的基因,并可促进移植组织血管新生.     

腺病毒介导的人内皮型——-氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（human endothelial nitric oxide synthase，heNOS）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表达。方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定；用PmeI线性化后去磷酸化的pShuttle—heNOS—EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy--1的感受态BJ 5183，使其在细菌内发生同源重组，获得阳性重组质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经Pac I酶切，转人AD 293细胞，包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。用重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP对MSCs进行转染，并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果：pShuttle—heNOS—EGFP与pAdeasy--1在BJ 5183中成功地发生了同源重组，得到了重组腺病毒质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论：采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中，并得到有效表达，且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

PRKAG2基因G100S新突变对心肌细胞钙稳态和糖原含量的影响

\[摘要\] 目的 探讨首次在国人WPW综合征(PRKAG2心脏综合征)家系中发现的一个新的错义突变PRKAG2 G100S引起心肌肥厚的可能机制。 方法 使用Invitrogen的GatewayTM重组系统构建含有人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)的重组腺病毒载体;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,将病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞后采用蛋白质印迹方法检测PRKAG2蛋白的表达。重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h前后以Rohd2/AM孵育并测定细胞内游离Ca2+浓度;感染乳鼠心肌细胞48～72 h 后以过碘酸雪夫(PAS)法测定细胞内糖原含量。结果 重组腺病毒分别感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞和SD乳鼠心肌细胞48 h后荧光显微镜下可观察到绿色荧光,用PRKAG2单抗能检测到靶蛋白。与野生型PRKAG2和EGFP组比较,重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h后突变体PRKAG2 G100S组细胞内游离Ca2+浓度无明显变化;重组腺病毒感染H9c2大鼠胚胎心肌细胞48 h前后的细胞内游离Ca2+浓度无明显变化。在重组腺病毒感染乳鼠心肌细胞48 h后,PRKAG2 G100S组能检测到明显的心肌细胞内糖原累积。结论 PKRAG2 G100S新突变导致心肌肥厚的主要发病机制可能是细胞内糖原累积,Ca2+及其介导的细胞内信号转导途径可能未参与心肌肥厚的发生。     

重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响

[目的]探讨转染人类抗凋亡基因bcl-xL能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价它对心肌细胞的抗凋亡作用.[方法]体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌缺氧模型;将携带人类bcl-xL基因的重组腺病毒感染心肌细胞;免疫细胞化学染色法分析bcl-xL蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;荧光显微镜下观察心肌细胞表达绿色荧光蛋白,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化.[结果]转染rAd-bcl-xL/s的心肌细胞表达bcl-xL蛋白阳性单位(PU)(17.84±3.42)明显高于正常对照组(11.02±2.56)与rAd-bcl-xL/as转染组(8.53±2.25)(P＜0.01);缺氧诱导后心肌细胞凋亡指数为(45.67±8.47)%,而转染rAd-bcl-xL/s后的细胞凋亡指数减少至(9.42±2.48)%,有显著性差异(P＜0.01),未见典型的凋亡小体.[结论]腺病毒介导的bcl-xL基因能高效转染心肌细胞,并表达目的基因;外源性bcl-xL基因对体外培养的心肌细胞具有抗凋亡作用,能够提高心肌细胞对缺氧的耐受性,促进损伤心肌的恢复.     

JNK抑制剂对H2O2诱导心肌细胞凋亡的保护作用

目的 观察特异性JNK抑制剂对H2O2诱导凋亡的培养乳鼠心肌细胞的保护作用，探讨热休克蛋白70（HSPT0）对H2O2诱导心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法 培养大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为4组，即正常对照组、H2O2损伤组、热休克组和JNK抑制剂组。应用免疫组化技术检测HSP70的表达；用透射电镜观察心肌细胞超微结构变化；用流式细胞仪分析心肌细胞凋亡百分率。结果 热休克预处理后HSP70在细胞浆内大量表达。JNK抑制剂明显抑制心肌细胞的凋亡率。结论 热应激预适应和JNK抑制剂对心肌细胞都具有保护作用，其保护机制可能与热应激时HSP70在心肌细胞内大量表达从而抑制了JNK的信号转导有关。     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP—70表达的改变

目的：探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。方法：第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(A／R组)、缺氧预适应组(IP组)和七氟醚预适应组(S组)，每组均缺氧2h，复氧48h。分别取复氧0，1，12，24，36和48h的细胞，用免疫组化染色检测HSP70表达并进行图象分析。结果：在各个时间点，S组和IP组间的HSP70表达均显著高于A／R组和C组(P＜0．01)，A／R组的HSP70表达略高于C组，S组和IP组间的HSP70表达差异无显著性(P＞0．05)。随着复氧时间的延长，S组和IP组间的HSP70表达从1h开始增加，24h表达最强，与1h相比差异具有显著性(P＜0．05)。结论：七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70在延迟相呈高表达，提示HSP70参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

KATP抑制剂对七氟醚诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的影响

目的探讨HSP70在七氟醚诱导乳鼠心肌细胞预适应中的作用及其内在联系. 方法第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧/复氧组、七氟醚组、优降糖组、优降糖+七氟醚组,每组均缺氧2 h,复氧48 h.分别取复氧0、1、12、24、36和48 h的细胞用免疫组化染色检测乳鼠心肌细胞HSP70的表达.结果在各个时点,七氟醚组的HSP70表达最强,显著高于正常对照组、缺氧/复氧组、优降糖组和优降糖+七氟醚组(P<0.01),随着复氧时间的延长,七氟醚组HSP70表达从1 h开始增加,24 h表达最强, 具有显著统计学意义(P<0.05).且优降糖+七氟醚组HSP70表达与正常对照组、缺氧/ 复氧组、优降糖组组间无显著性差异(P>0.05).结论 HSP70和K ATP 通道均参与了七氟醚诱导乳鼠心肌细胞产生预适应过程,阻止KATP通道则抑制HSP70 的表达.     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变

目的 :探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白 70表达的影响。方法 :第 2代培养心肌细胞随机分为正常对照组 (C组 )、缺氧 /复氧组 (A/R组 )、缺氧预适应组 (IP组 )和七氟醚预适应组 (S组 ) ,每组均缺氧 2h ,复氧 48h。分别取复氧 0 ,1,12 ,2 4,36和 48h的细胞 ,用免疫组化染色检测HSP70 表达并进行图象分析。结果 :在各个时间点 ,S组和IP组间的HSP70 表达均显著高于A/R组和C组 (P <0 .0 1) ,A/R组的HSP70 表达略高于C组 ,S组和IP组间的HSP70 表达差异无显著性 (P >0 .0 5 )。随着复氧时间的延长 ,S组和IP组间的HSP70 表达从 1h开始增加 ,2 4h表达最强 ,与 1h相比差异具有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70 在延迟相呈高表达 ,提示HSP70 参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

去甲肾上腺素诱导热休克蛋白70保护心肌细胞的机制

目的探讨去甲肾上腺素预处理心肌细胞后诱导心肌热休克蛋白70(HSP70)的表达及其对心肌细胞保护作用机制。方法 Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养,分为3组:对照组:心肌培养3～5天未施加任何因素;缺氧/复氧组:心肌细胞培养3～5天后,模拟缺氧(加入饱和氮气pH 6.8 D-Hank’s液培养细胞)3 h,复氧(用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞)孵育6 h;去甲肾+缺氧/复氧组:模拟缺氧前30 min加入100 nmol/L去甲肾,其它同缺氧/复氧组。测定心肌HSP70和bcl-2以及相关的细胞凋亡指标。结果 HSP70和bcl-2的表达在去甲肾+缺氧/复氧组明显高于缺氧/复氧组,去甲肾+缺氧/复氧组的细胞凋亡率明显低于缺氧/复氧组。结论去甲肾上腺素预处理可能通过诱导心肌组织HSP70和bcl-2高表达,发挥其对供心的保护作用。