MAPK信号转导在缺氧/复氧性心肌细胞凋亡中的作用

细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而导致的细胞自杀,由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程;心肌细胞缺氧/复氧(H/R)存在细胞凋亡。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞应激反应的重要信号分子,在H/R性心肌细胞凋亡中起着重要的作用,深入研究MAPK在心肌细胞凋亡中的作用,对临床上防治心肌缺血/再灌注损伤具有非常重要的指导意义。     

缺氧与缺氧/复氧诱导肥大的心肌细胞凋亡

目的探讨缺氧与缺氧/复氧诱导肥大的心肌细胞凋亡效应。方法应用血管紧张素Ⅱ诱导培养的新生小鼠心肌细胞肥大,并给予缺氧、缺氧/复氧刺激,用Hoechst33258染色法检测细胞凋亡率。结果肥大心肌细胞在缺氧8h时即出现显著的细胞凋亡。缺氧时间延长至12h时其凋亡率较8h时显著增加(P<0.05)。肥大心肌细胞在缺氧后/复氧4h,细胞凋亡率比单纯缺氧时进一步增加(P<0.05)。缺氧或缺氧/复氧时,肥大的心肌细胞组的凋亡率均较正常心肌细胞组显著增高(P<0.05)。结论缺氧可诱导肥大的心肌细胞凋亡,且在缺氧后复氧可加重肥大心肌细胞凋亡的程度;与正常心肌细胞相比,缺氧及缺氧/复氧刺激更易引起肥大的心肌细胞凋亡。     

LncRNA Mirt2通过调控MKP-1/JNK通路保护心肌细胞避免缺氧复氧损伤

目的 探讨LncRNA Mirt2在心肌细胞H9C2缺氧复氧损伤过程中的作用及其机制.方法 检测LncRNAMirt2在急性心肌损伤患者血液中的水平.建立H9C2心肌细胞缺氧复氧模型,检测LncRNA Mirt2在H9C2缺氧复氧模型中的表达.采用脂质体转染法将LncRNA Mirt2 mimics和阴性对照转染入H9...     

缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化

目的:研究缺氧-复氧诱导人肥大心肌细胞凋亡信号的变化. 方法:通过胶原酶/胰酶联合消化法获取成人肥大心肌细胞,采用缺氧-复氧诱导细胞凋亡,改良TUNEL法检测细胞凋亡率,并用免疫细胞化学法检测bcl-2、bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白的变化,用原位杂交法检测bcl-2 mRNA、caspase3 mRNA和Akt1 mRNA表达的变化. 结果:缺氧24 h-复氧4 h后细胞凋亡率为(17.50±0.67)%,对照组为(2.88±0.27)%;凋亡信号的平均吸光度(A)值:bcl-2为0.189±0.006,对照组为0.238±0.004;bax为0.240±0.002,对照组为0.218±0.004;caspase-3为0.230±0.002,对照组为0.202±0.004;细胞色素C为0.225±0.003,对照组为0.191±0.009;磷酸酪氨酸蛋白为0.186±0.005,对照组为0.154±0.003;bcl-2 mRNA为0.300±0.003,对照组为0.360±0.001;caspase 3 mRNA为0.307±0.004,对照组为0.271±0.002;Akt1 mRNA为0.274±0.007,对照组为0.301±0.008,差异均有统计学意义(P<0.01). 结论:缺氧-复氧可造成人肥大心肌细胞凋亡,bcl-2蛋白及Bcl-2 mRNA和Akt1 mRNA表达降低,bax、caspase3、细胞色素C和磷酸酪氨酸蛋白及caspase3 mRNA表达增加.     

LXA4通过p38MAPK/Nrf2信号通路诱导H9c2心肌细胞HO-1高表达

目的:探讨脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)诱导心肌细胞H9c2中血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)-1表达可能涉及的信号转导通路?方法:分别用核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)的抑制剂ATRA?p38MAPK的抑制剂SB203580?LXA4联合ATRA?LXA4联合SB03580预处理H9c2细胞后进行缺氧/复氧处理,RT-PCR?Western blot?免疫荧光等检测HO-1?Nrf2以及p38MAPK mRNA和蛋白表达的变化?结果:与只行缺氧/复氧处理的细胞相比,LXA4预处理的H9c2细胞HO-1 mRNA和蛋白的表达明显升高(P < 0.05),而ATRA?SB203580分别抑制了Nrf2的聚集和p38MAPK的磷酸化(P < 0.05),从而抑制了LXA4对HO-1的诱导(P < 0.05)?结论:LXA4预处理诱导心肌细胞H9c2的HO-1高表达,具有抗缺氧/复氧损伤的作用,其机制与p38MAPK/Nrf2信号通路有关?     

缺氧预处理对人心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其机制

目的：探讨缺氧预处理（ＰＣ）对于人类心肌细胞缺氧复氧（Ｈ／Ｒ）损伤的影响及其机制。方法：在体外分离的人心房和心室肌细胞的Ｈ／Ｒ模型上观察缺氧ＰＣ的作用，及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂与蛋白磷酸酶激动剂和抑制剂对ＰＣ现象的影响。结果：缺氧ＰＣ明显减轻Ｈ／Ｒ造成的心肌细胞损伤，ＰＫＣ抑制剂Ｈ７和蛋白磷酸酶激动剂ＢＤＭ分别完全消除ＰＣ的细胞保护，而蛋白磷酸酶抑制剂ＯＡ则能模拟ＰＣ的上述保护效应。结论：人类     

心肌细胞缺氧/复氧模型的构建及研究进展

心肌细胞缺氧/复氧模型是模拟心肌缺血再灌注损伤及相关疾病的经典细胞模型,具有操作便捷、直观形象、稳定性好等优势,可准确反映疾病细胞水平的病理改变,广泛应用于药物与疾病的分子机制研究。缺氧/复氧是导致多种心血管疾病的主要机制之一,构建理想的心肌细胞缺氧/复氧模型是深入研究心血管疾病机制的基础,目前该模型的构建方法较多,主要包括物理法(混合气体培养法、厌氧袋/罐法、液体石蜡封闭法)、化学法(氧耗法、超氧法、酶抑法和缺氧液法)和联合法等,其中混合气体培养法和氧耗法最常用。     

加味丹参饮抑制p38MAPK表达保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞损伤的实验研究

目的 观察加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)乳鼠心肌细胞p38 MAPK蛋白表达的影响, 以探讨其保护心肌的作用机制. 方法 将20只SD乳鼠的心肌细胞进行原代培养, 建立H/R模型并随机分为H/R组、SB203580 (p38MAPK阻断剂组)、加味丹参饮含药血清组,正常心肌细胞组作为对照组. 采用T淋巴细胞化学染色法鉴定心肌细胞,罗丹明B(Rhodamine B)染色法观察细胞形态,MTT 比色法检测含药血清对乳鼠心肌细胞的毒性,Western-blot 法检测MKK3 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶3)、MKK6 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶6)、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表达. 结果 与正常血清对照组比较,H/R组MKK3、MKK6的蛋白表达增多,p38MAPK通路阻断剂SB203580和加味丹参饮均不能减少其表达;p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R 时表达均增加(P<0.01),而SB203580 和加味丹参饮含药血清均能减少其表达(P<0.01). 结论 加味丹参饮含药血清预处理可通过抑制缺氧,复氧心肌细胞p38MAPK信号通路发挥保护作用,抑制p38MAPK表达及其磷酸化,减轻心肌细胞损伤,起到保护心肌细胞的作用.     

乔松素通过调节HIF-1α/BNIP3信号通路介导细胞自噬减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的：探究乔松素通过调节缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路介导细胞自噬减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的机制。方法：体外培养大鼠心肌细胞H9c2,建立H/R模型后以0、25、50、100、200、300μg/mL乔松素处理24h,采用MTT法检测各处理组细胞活力,筛选出合适的药物作用浓度。将体外培养的H9c2细胞随机分为对照组、模型组、乔松素低剂量组、乔松素高剂量组、HIF-1α siRNA阴性对照组、乔松素高剂量+HIF-1α siRNA组,除对照组外其余各组建立H/R模型,然后以乔松素、HIF-1α siRNA及其阴性对照分组处理后,采用MTT法、流式细胞实验分别检测各组细胞增殖及凋亡;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测量各组H9c2细胞炎性因子白细胞介素（IL）-17、IL-1β、IL-18水平;采用试剂盒测量各组H9c2细胞氧化应激因子过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平;采用单丹磺酰戊二胺（MDC）荧光染色法检测各组H9c2细胞自噬体的形成;采用免疫印迹法...     

Maresin 1激活Nrf2信号通路减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

目的 探讨Maresin 1(MaR1)对低氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的影响和作用机制。方法 培养小鼠HL-1心肌细胞,采用低氧孵育6 h和复氧12 h来构建低氧/复氧细胞模型。小鼠HL-1心肌细胞分为常氧对照组(常氧培养18 h)、低氧/复氧组(低氧培养6 h,然后复氧处理12 h)、低氧/复氧+溶剂组(加入溶剂对照二甲基亚砜预处理30 min后,进行低氧/复氧处理)、低氧/复氧+MaR1组(加入50 nmol/L的MaR1预处理30 min后,进行低氧/复氧处理)和低氧/复氧+MaR1+ML385组(加入50 nmol/L的MaR1和5μmol/L的ML385预处理30 min后,进行低氧/复氧处理)。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)方法检测细胞存活率。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)细胞毒性检测试剂盒检测细胞损伤。TUNEL试剂盒检测细胞凋亡。活性氧(reactive oxygen species, ROS)试剂盒法检测ROS水平。丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒法检测MDA含量...     

液体石蜡封闭法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型

目的:探讨液体石蜡封闭法建立大鼠心肌细胞H9C2缺氧/复氧损伤模型的可行性与稳定性。方法:将体外培养在六孔板中的大鼠心肌细胞H9C2随机分为对照组和实验组,对照组常规培养不做处理,实验组每孔细胞用高温灭菌的液体石蜡2mL封闭,造成缺氧环境,缺氧时间段分别为2、4、8、12h,处理结束后吸除石蜡,加入新鲜DMEM培养基,置二氧化碳培养箱中继续培养2h。超氧阴离子探针Dihydroethidium检测活性氧自由基含量变化;AnexinV/PI染色行流式细胞术检测不同时间缺氧/复氧处理后细胞凋亡率。结果:对照组细胞产生少量氧自由基;实验组随缺氧/复氧时间延长,氧自由基含量逐渐增加,缺氧2、4、8、12h细胞凋亡率分别为(0.76±0.15)%,(5.22±0.74)%,(10.36±2.07)%,(31.00±4.32)%,与对照组相比除缺氧2h组外其余三组均有显著性差异(P<0.05)。结论:液体石蜡封闭法建立H9C2缺氧/复氧损伤模型简单易行、重复性好。     

Ghrelin对缺氧／复氧心肌细胞凋亡的影响及其机制的研究

目的:本实验研究Ghrelin对缺氧/复氧干预下心肌细胞凋亡的影响以及其具体的作用机制.方法:用体外培养的SD乳大鼠心肌细胞,建立缺氧(4 h)/复氧(1h)模型.实验分4组:①对照组;②缺氧/复氧组(H/R);③H/R+Ghrelin干预组;④H/R+Ghrelin+沃曼青霉素干预组.分别检测各组培养液中LDH浓度,Tunel法测定各组细胞凋亡率,免疫印迹法检测细胞内激酶磷酸化Akt的表达.结果:实验发现,与H/R组和H/R+Ghrelin+沃曼青霉素干预组相比H/R+Ghrelin组能明显减轻缺氧/复氧损伤所导致的LDH的漏出(30.00±6.60与78.00±4.20U/L;30.00±6.60与61.67±7.22U/L),以及明显减低心肌细胞的凋亡率(0.0859±0.0303与0.3516±0.06329;0.0859±0.0303与0.3255±0.02258)(P<0.05).同时H/R+Ghrelin干预组磷酸化Akt的表达明显增强.结论:Ghrelin具有减轻缺氧/复氧所引起的心肌细胞损伤,抑制心肌细胞凋亡的作用.与Ghrelin激活细胞内信号传递途径PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/丝-苏氨酸激酶)有关.     

建立新生大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型

目的：探讨缺氧密闭法建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型的可行性与稳定性。方法：将体外培养的新生SD大鼠心肌细胞随机分为对照组（不做处理）和实验组（进行不同时间（30min、1-4h）的缺氧／复氧处理）。DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）浓度;AO／EB双染法及AnexinV／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：对照组ROS浓度及细胞凋亡率均较低;而实验组随着缺氧时间的延长,ROS浓度逐渐增加,细胞凋亡数逐渐增多。不同缺氧时间段细胞凋亡率与对照组比,除缺氧30min组外,1-4h组差异均有统计学意义（P〈0．05,P〈0．01）。结论：厌氧产气袋．缺氧密闭系统建立新生SD大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型稳定、可行且重复性好。     

钙敏感受体在缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的:观察钙敏感受体(CaSR)在乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型中对细胞凋亡的影响.方法:利用原代培养的SD乳鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤(H/R)模型,分正常对照组、缺氧复氧组、激动剂组、阻断剂组、肝细胞生长因子(HGF)小(10 ng/m1)、中(20 ng/m1)大剂量(40 ng/ml)组.运用TUNEL染色方法检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR检测心肌细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定培养液LDH含量.结果:与对照组相比,H/R组细胞凋亡率、LDH和TNF-α表达增高(p<0.01),给予CaSR激动剂后这三者的表达均进一步升高(P<0.01).而给予阻断剂后这三者的表达与激动剂组相比,差别无统计学意义(P>0.05),而HGF小、中和大剂量组这三者的表达较阻断剂绢进一步下降,且呈剂量依赖性.结论:CaSR激活后可能通过引起细胞内钙超载、自由基产生增多、TNF-α等炎性因子合成增多,参与了心肌缺血再灌注损伤,促进心肌细胞凋亡.而HGF预处理可以明显降低缺血再灌注心肌细胞的凋亡,减轻缺氧复氧心肌细胞损伤,保护心肌,且呈量效关系.     

17β-雌二醇对机械牵拉诱导心肌细胞肥大Integrin?1/FAK/p38 MAPK信号通路的影响

【】目的：研究17β雌二醇(17β-estradiol,E2)对体外机械牵张诱导心肌细胞肥大Integrin?1/FAK/p38 MAPK信号通路的影响。方法：以机械牵张刺激体外培养的新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用免疫共沉淀方法检测Integrin?1和FAK的结合情况,Western blot方法检测FAK和p38 MAPK磷酸化水平的变化。结果：机械牵拉心肌细胞24小时后,Integrin?1和FAK的结合显著增加,FAK和p38 MAPK磷酸化水平亦明显增强。100nmol/L E2预处理30分钟可明显减轻机械牵拉诱导的心肌细胞Integrin?1和FAK的结合增加,及抑制FAK和p38 MAPK磷酸化的水平增强,该效应可被雌激素受体非特异性拮抗剂ICI182780逆转。结论：一定水平的E2能够抑制机械牵拉诱导心肌细胞肥大发生发展过程中 Integrin?1/FAK/p38 MAPK信号通路的激活发挥心血管保护作用。     

BRD4基因对TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡和p38MAPK信号通路的影响

目的：探讨溴结构域蛋白4（BRD4）基因对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的心肌细胞凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将H9c2细胞分为空白对照组、si-CN组（转染阴性对照siRNA）和si-BRD4组（转染特异性siRNA）,采用Western blotting法检测各组细胞中BRD4蛋白表达水平。大鼠心肌H9c2细胞随机分为对照组、TGF-β1组（20μg·L^-1TGF-β1处理细胞24 h）、si-NC+TGF-β1组（转染阴性对照的siRNA后,使用TGF-β1处理细胞24 h）和si-BRD4+TGF-β1组（转染BRD4特异性siRNA后,使用TGF-β1处理细胞24h）。MTT法检测各组细胞增殖活性,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中BRD4、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase3）、P38和磷酸化P38（p-P38）蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较,si-BRD4组H9c2细胞中BRD4蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与对照组比较,TGF-β1组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,Bax、Cleaved caspase3和p-P38蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与TGF-β1组比较,si-BRD4+TGF-β1组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）,细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,Bax、Cleaved caspase3和p-P38蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。结论：抑制BRD4基因表达可减弱TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路有关。     

芬太尼对缺氧复氧损伤相关的心肌细胞凋亡的影响

目的观察不同剂量芬太尼对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响,在细胞水平上为临床应用芬太尼减轻心肌缺血再灌注损伤提供理论依据。方法以常规方法制备与培养心肌细胞。实验分为正常对照组（C组）、单纯缺氧复氧组（A/R组）、各试验组（F1、F2、F3、F4组）。C组不经任何处理。A/R组、各试验组均经历2h缺氧及1h复氧。缺氧前,各试验组分别给予终浓度为2、10、50、250ng/ml的芬太尼。分别以MTT快速比色法检测细胞存活情况（OD值）、流式细胞仪检测细胞凋亡率及透射电子显微镜观察细胞超微结构改变。结果各试验组OD值均显著高于A/R组,细胞凋亡率显著低于A/R组,电镜显示A/R组细胞超微结构改变呈典型的凋亡细胞形态学改变,F3组细胞形态大致正常,凋亡细胞少见。F3组（50ng/ml）在所有试验组中OD值最高,细胞凋亡率最低。芬太尼剂量在50ng/ml内,OD值与剂量呈正相关（r=0.720,P〈0.01）,细胞凋亡率与剂量呈负相关（r=-0.990,P〈0.01）。结论①芬太尼对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用;②在一定剂量范围内芬太尼的保护效应与剂量成正相关。     

PTP-1B小干扰RNA对缺氧/复氧诱发的大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B（PTP1B）小干扰RNA对缺氧/复氧诱发的大鼠心肌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法分离的大鼠心肌细胞在PTP-1B小干扰RNA转染后培养24h，然后缺氧处理4h，再复氧6h（4H／6R）。心肌细胞的凋亡用TUNEL染色法测定；Westernblot检测心肌细胞PTP-1B和磷酸化Akt的表达水平；比色法衡量凋亡酶Caspase3和Caspase8的活性；共免疫沉降法检测与Fas受体结合的PTP-1B的数量。结果缺氧／复氧的处理不仅严重损伤了培养的大鼠心肌细胞，同时也上调了心肌细胞PTP1B蛋白的表达水平；PTP-1B小干扰RNA显著地减少了缺氧／复氧诱发的心肌细胞凋亡，PTP-1B小干扰RNA组与阴性对照组的凋亡指数分别为：（12．1&#177;1．4）％和（23．2&#177;1．6）％，P％0．05；与阴性对照组比较，PTP-1B小干扰RNA显著增加了Akt的磷酸化水平，抑制了Caspase3和Caspase8的酶活性，同时降低了PTP-1B与Fas受体的结合。结论PTP-1B是一个缺氧／复氧（4H／6R）诱发的心肌细胞凋亡的关键调节因子，针对PTP-1B的小于扰RNA可有效地抑制心肌细胞的损伤。其机制可能与增加的Akt磷酸化水平，凋亡酶Caspase3和Caspase8的酶活性被抑制，以及PTP1B与Fas受体结合的减少相关联。