β-葡萄糖苷酶的发酵工艺优化及在木糖渣酶水解中的应用

木糖渣有较高的纤维素含量,可以用作诱导产生β-葡萄糖苷酶的碳源。本文以木糖渣为诱导碳源,优化了黑曲霉发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺。首先利用Plackett-Burman实验设计在6个因素中筛选出了影响产酶的主要因素,分别为麦麸、硫酸铵、硝酸钠。在筛选基础上,利用三因素五水平的中心组合对3个因素进行了进一步的优化,并用响应优化器得到了产酶的最佳条件麦麸、硫酸铵、硝酸钠的浓度分别为26.7g/L、10.0g/L、10.0g/L,在得到的最佳条件下,酶活可以达到15.0IU/mL。对拟合模型进行了方差分析,结果表明模型的R²值为92.12%,P值为0,模型拟合较好,可以对实验结果进行预测。以木糖渣为底物,用诱导制备的复配酶液验证了其水解效率,结果表明当里氏木霉粗酶液与黑曲霉粗酶液1：1复配时,酶水解效率为里氏木霉粗酶液的4倍。     

- 葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

超滤分离里氏木霉木聚糖酶的研究

研究了进料速度、操作压力、木聚糖酶活大小对内切-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶超滤分离的影响。结果表明,用超滤的方法可以将内切-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶很好地分离,内切-β-木聚糖酶活的收率随着进料速度的提高而增加,当进料速度从 300mL/min 提高到 450 mL/min 时,内切-β-木聚糖酶活的收率从 79.21%提高到 91.35%;内切-β-木聚糖酶活的收率随着操作压力的提高而降低,当操作压力从 4 kPa 提高到15 kPa 时,内切-β-木聚糖酶活的收率从 89.91%下降到 66.48%,而且操作压力越大越容易阻塞超滤膜;内切-β-木聚糖酶活的收率随着酶活的降低而增加,当总木聚糖酶活一定时,木聚糖酶活从 45.18 IU/mL 下降到 22.59 IU/mL 时,内切-β-木聚糖酶活的收率从 82.63%提高到 89.91%,木聚糖酶活较低时,酶液的体积增大,超滤时间过长,也会导致内切-β-木聚糖酶活收率降低。因此,在木聚糖酶活较低的情况下(酶活为22.59 IU/mL),温度为 25℃时,内切-β-木聚糖酶和β-木糖苷酶的适宜的分离条件为:压力为 4 kPa,进料速度为 450 mL/min,内切-β-木聚糖酶活的收率为 91.35%。     

低聚木糖生产用木聚糖酶的选择性合成

以里氏木霉(Trichoderma reesei)Rut C-30为产酶菌,研究了碳源、碳氮比对木聚糖酶酶系组成的影响.低分子量组分较多的木聚糖有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,酶解产物中低聚木糖的含量较高(80.70%).低碳氮比有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成,抑制外切-β-木糖苷酶的合成.以低分子量较多的木聚糖(7g/L)为碳源,降低培养基的碳氮比为4.0,调控培养60h,用该木聚糖酶酶解粗木聚糖,产物中低聚木糖占总糖的86.32%.     

绳状青霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

从绳状青霉（Penicillium funiculosum）深层发酵液中分离得到一种未知的β-葡萄糖苷酶,并对其酶学性质进行初步分析.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-25离子交换层析、Sephadex G-50凝胶过滤层析等步骤,获得了一种凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶,经SDS-PAGE测得其分子量为19 kDa,其最适反应温度为60℃、最适反应pH值为4.5.     

海藻糖合酶的分离纯化及部分酶学性质

用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析对一株芽孢杆菌SH-110产生的海藻糖合酶粗酶液进行纯化,用PAGE电泳逐步分析纯化的结果,用SDS-PAGE电泳证明该酶的分子量为62.4 kD。酶反应最适pH值为7.0,最适作用温度为35℃,金属离子Zn2+、K+、Na+对酶活性有激活作用,Ba2+、Ca2+、Mn2+对酶活性有抑制作用。酶底物专一性初步分析结果表明,该酶确实是以麦芽糖为专一性底物来转化生成海藻糖的海藻糖合酶的一种新酶。     

低聚木糖生产用里氏木霉木聚糖酶选择性合成的研究现状

对低聚木糖生产用里氏木霉木聚糖酶选择性合成的研究现状进行了较全面的总结和评述。系统地介绍了里氏木霉木聚糖酶的的多样性以及碳源、pH和碳氮比等培养条件对合成内切木聚糖酶和木糖苷酶的影响,提出了调控这些培养条件选择性合成低木糖苷酶活的木聚糖酶的方法。     

真菌细胞溶壁酶的分离纯化及其酶学性质研究

采用长梗木霉(Trichoderma Longibrachiatum Rifai)958-11菌株,经过发酵,分离提纯出一种真菌细胞溶壁酶,并对其进行酶学性质研究。长梗木霉培养,利用:(NH4)2SO4沉淀,sartobind S离子交换层析和Sephacryl S-200柱层析对该发酵液进行分离纯化,用担子菌做为酶反应的底物研究该酶的酶学性质。经发酵获得的酶液,可在最佳反应条件下,1～2h内产出原生质体105～106个/毫升酶液。酶反应最适温度为30℃,最适pH为5.4,可以在0.6mol/L的氯化钾或0.6mol/L的硫酸镁为等渗液的条件下,溶解部分担子菌的细胞壁,得到高活力的原生质体。     

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶(C1)高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C1酶活力可达18.24 U·ml-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明:重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·(g底物)-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。     

里氏木霉LW1产纤维素酶的酶学性质

研究了里氏木霉LW1所产纤维素酶的主要酶学性质。结果表明,该纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH值为4.8;在30～50℃,pH 4.0～6.0范围内有较高的稳定性;90℃处理15 min,酶粉的CMC酶活和FPA酶活保存率分别为38.66%和52.68%;Ca2+、K+、Na+、Mg2+离子对酶活有激活作用,Mn2+、Zn2+、Cu2+离子有抑制作用。     

壳聚糖降解酶的分离纯化及性质研究

青霉菌（Penicillium sp菌株）发酵液经20%-70%硫酸铵分级沉淀，DEAE-Cellulose离子交换层析，SephadexG-100凝胶过滤层析，得到聚丙烯酸胺凝胶电泳均一的壳聚糖酶，该壳聚糖酶具有很强的底物专一性。     

酸性蛋白酶AP-10分离纯化及其酶学性质

采用活性炭吸附脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等技术对酸性蛋白酶AP-10浓缩液进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,分离纯化后得到的酸性蛋白酶AP-10纯组分比酶活为5 800 U·mg^-1,纯化倍数为6倍;最适反应温度为40℃,热稳定范围为30～45℃;最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.5～6.5;Mn²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的激活作用,Fe²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的抑制作用。为拓展酸性蛋白酶AP-10的应用及开发高品质产品奠定了基础。     

Rhodococcus boritolerans FW815腈水合酶分离纯化及其酶学性质研究

Rhodococcus boritolerans FW815具有高效水合2,2-二甲基环丙甲腈活性,利用蛋白质柱层析技术从中分离得到R.boritolerans FW815腈水合酶。实验结果表明,该腈水合酶分子量为40 kDa,由大小分别为24 kDa、22 kDa两种亚基构成。R.boritolerans FW815腈水合酶最适作用温度为37℃,最适作用pH值7.0。Cu2+、Zn2+、Ni2+等金属离子及EDTA对该腈水合酶有较强的抑制作用。除2,2-二甲基环丙甲腈、2-氨基-2,3-二甲基丁腈之外,R.boritolerans FW815腈水合酶对2-氧代-1-吡咯烷基丁腈、丙烯腈、2-氨基-4-甲硫基丁腈也表现出腈水合酶活性。     

胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究

通过PCR从大肠杆菌(E.coli K12)基因组DNA中扩增出胱硫醚β-裂解酶(Cystathionineβ-1yase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组菌E.coli BL21(pETDuet- 1-CBL).重组菌在30℃、0.5 mmol·L-1 IPTG存在条件下诱导9h,可溶性CBL的表达重达18...     

绿僵菌几丁质酶的分离纯化及性质

从自然罹病死亡的金龟子体内分离到一株金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）,它在几丁质的诱导下能产生较高活性的几丁质酶.发酵液经硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析、Phenyl Sepharose^TM 6 Fast Flow疏水柱层析等方法,得到电泳纯的几丁质酶.用SDS-PAGE测得该酶相对分子质量为61.5 kD,而经质谱分析为57.14 kD.最适反应温度为55 ℃,最适反应pH值为6.0,酶的等电点pI为4.02,其N末端序列为VIGPAAPL,用硫酸-酚法测得其含糖量为56.2%.水解几丁质的K_m为14.5 μmol•L^-1.该酶在45 ℃,pH值3.0～9.5较为稳定.Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺和Mn²⁺离子对几丁质酶活性有明显的促进作用,而Hg²⁺、Co²⁺和Fe²⁺离子完全抑制几丁质酶的活性.此酶还可被EDTA所抑制,表明金属离子为其活性所必需.PMSF试剂对几丁质酶的活力影响比较大,丝氨酸可能是酶活力的必需基团.     

壳聚糖酶的分离提纯及其酶学性质研究

从土壤中筛选获得的高产壳聚糖酶菌株Penicillium sp.ZD-Z1,经发酵、分离提取出两种壳聚糖酶A和酶B,并对它们分别进行酶学性质测试.分别测定酶A和酶B的等电点、相对分子质量、最适反应温度和pH、不同脱乙酰度的壳聚糖对酶活的影响.并考察了两种壳聚糖酶的酶解方式,结果表明,酶A为内切酶,酶B为外切酶.     

雷丸的中性金属蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外驱虫活性

A neutral metalloprotease was purified from the cultured mycelia of Laccocephalum mylittae, an effective medicinal fungus widely used in anthelmintic therapy. The protease was purified to homogeneity with 31.85-fold purification and a final yield of 21.76%. The subunit molecular weight of the protease is about 40000 estimated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The optimum reaction pH and temperature are 7.5 and 50ºC, respectively. The protease activity is largely enhanced by Ca2+, but highly inhibited by tetrasodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), a metal-chelator, suggesting that the enzyme is a metalloprotease. The Michaelis-Menten constan Km and Vmax value for casein substrate are 6.09 mg&;#8226;ml－1 and 21.32 μg&;#8226;min－1&;#8226;ml－1, respectively. In vitro anthelmintic tests of the protease exhibit distinct lethal effects on the third stage larvae (L3) of Ascaris suum. Scanning electron microscopy and SDS-PAGE analysis indicates that the proteolysis of larvae proteins caused by this protease may relate to the anthelmintic activity of L. mylittae.     

Botrytis cinerea蛋白磷酸酶的分离纯化及酶学性质

[目的]植物真菌病害灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起,它在世界范围内造成了严重的经济损失.B.cinerea易对化学药剂产生抗性,寻找更多对灰霉病有特效的生物农药是目前急需解决的难题.鉴于顺丁烯二酸酐类化合物良好的生物活性,研究此类化合物对蛋白磷酸酶的抑制效果.[方法]将发酵优化后的B.cinerea菌体经超声破碎、硫酸铵分级盐析、透析浓缩、DEAE-Sepharase离子交换层析等步骤分离纯化,并以SDS-PAGE验证酶纯度.考察所得纯酶的酶学性质,研究顺丁烯二酸酐类化合物对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用.[结果]经分离纯化后,该酶SDS-PAGE为单一条带,提纯倍数达30.79倍,酶活回收率为39.26％.酶学特性研究结果表明其最适反应pH值为4.0,最适反应温度为37℃.该酶在pH值3.0～6.0,50℃以下内稳定.考察金属离子对B.cinerea蛋白磷酸酶酶活的影响,发现Mg2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+能提高该酶活性,Zn2+、Cu2+、Mn2+对酶活有抑制作用.以p -NPP为底物的酶动力学参数Vmax和Km分别为12.71 mmol/(L·min)与12.84 mmol/L.4种顺丁烯二酸酐类化合物对B.cinerea蛋白磷酸酶的抑制作用由大到小排名为苯基马来酸酐、4,5-二氯邻苯二甲酸酐、二甲基马来酸酐、顺丁烯二酸酐.[结论]此酶分离纯化步骤少,减少了酶活损失.以纯化的蛋白磷酸酶为靶标,顺丁烯二酸酐类化合物对酶活抑制效果良好,可研究抑制灰霉病机理及作为生物源农药开发.     

-乳酸的研究

从所选取的产l-乳酸的4株菌中筛选出一株性能优良、糖利用率和乳酸产量较高的菌种作为试验用菌种。对影响乳酸菌发酵大豆秸秆酶解物制备l-乳酸的因素进行了研究,影响大豆秸秆酶解液发酵的主要因素是菌种类型、底物糖浓度、接种量、温度及pH值。结果表明:干酪乳酸菌是较适宜的发酵菌种,较适宜的发酵条件为:发酵温度30℃,接种量10%,pH值5.5。随着底物糖含量的增加,乳酸产率相应增大,在实验范围内,乳酸菌发酵所产乳酸的产率达到80%。     

聚乙烯醇脱氢酶的分离纯化及其酶学性质

采用(NH4)2SO4分级沉淀及Q-Sepharose HP柱层析两步纯化,首次从可高效降解聚乙烯醇(PVA)的混合菌系发酵产物中分离纯化获得了纯蛋白聚乙烯醇脱氢酶(PVADH),并对其酶学性质进行了研究. 结果表明,PVADH分子量为134.3 kDa,最适作用温度为35℃,最适作用pH值为7.5;PVADH以仲醇为底物时酶活性普遍高于以其他醇类为底物时,PVADH与PVA反应产物中检测到羰基化合物,证实PVADH对PVA有降解作用.