弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系的建立

目的 建立弓形虫速殖子与缓殖子体外转化体系.方法 纯化弓形虫RH株速殖子,按一定比例和条件接种于COS-7细胞内进行体外培养.分别在接种后第1、2、3、4、5、6天观察细胞和虫体的形态并提取Total RNA,用RT-PCR的方法检测速殖子期特异性蛋白SAG1基因、缓殖子期特异性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表达.结果 随着速殖子在COS-7细胞中培养时间的延续,虫体的数量逐渐增多,但增殖速度逐步减缓;虫体在细胞内的排列方式也在不断变化,由成对的弧形、玫瑰花形或簇形、变成半圆形最后形成圆形的类包囊样结构.RT-PCR检测显示:速殖子期特异性蛋白SAG1基因在培养的第1～6天均有表达,且表达量呈递增趋势;缓殖子期特异性蛋白BAG1基因从第2天开始出现表达,随时间延续表达量逐渐增加;缓殖子期特异性蛋白SAG2C基因从第5天开始表达,第6天表达量增加.以上结果表明有越来越多的速殖子转化为缓殖子.改变培养条件,缓殖子也能向速殖子转化.结论 成功构建弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转化体系,为其转化机制的研究奠定了基础.     

酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析

研究弓形虫功能性抗原,为开发弓形虫病诊断试剂及疫苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫 酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）和免疫印迹方法,对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和 弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果：弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中 用１２５ ｇ／Ｌ的分离胶可产生较好的分辨率,分离出 ３０多条区带。免疫印迹分析表明 ２种抗血清均能特异地识别弓 形虫速殖子抗原,共同识别的抗原组分相对分子质量为 ４３ ０００、３３ ０００、２７ ０００、１４ ０００。结论：这些抗原组分是诱导 宿主产生对弓形虫感染免疫应答的功能性抗原。     

酶联免疫印迹法对弓形虫速殖子功能性抗原分析

目的：研究弓形虫功能性抗原,为开发弓形虫诊断试剂及商苗提供理论基础。方法：采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹方法,对弓形虫抗原及弓形虫速殖子抗原中能与免疫兔血清和弓形虫抗体阳性人血清起特异性反应的抗原组分进行分析。结果;弓形虫速殖子抗原的蛋白组分在ＳＤＳ－ＡＧＥ中用１２５ｇ／Ｌ的分离胶可产生较好的分辨率,分离出３０多条区带。     

刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定

目的: 分离与鉴定刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株速殖子外泌体。方法: 收集弓形虫速殖子与人结肠癌SW480细胞共培养上清液,经离心、过滤,采用基于聚合物沉淀技术的试剂盒法分离外泌体;透射电镜观察外泌体形态特征,纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒径大小,蛋白质印迹法检测外泌体经典标志分子CD63、HSP70以及弓形虫特异蛋白表面抗原1（surface antigen 1,SAG1）、棒状体蛋白16（rhoptry protein 16,ROP16）、ROP18和致密颗粒蛋白1（dense granule protein 1,GRA1）。结果： 从弓形虫与细胞共培养上清液中分离出囊泡样物质,其外形为圆形,有完整的膜结构,直径为30~150 nm;表达外泌体特异性蛋白CD63、HSP70;检测出弓形虫特异性蛋白SAG1、ROP16、ROP18和GRA1。结论： 从弓形虫速殖子与SW480细胞共培养上清液中获得弓形虫外泌体。     

弓形虫急慢性感染的生物学基础及其研究进展

弓形虫是一种条件致病原虫,可造成人体急性和慢性感染。本文针对弓形虫急、慢性感染的生物学基础,从体外条件、人体的免疫力、特异性蛋白、中间体、离子通道和传导通路等方面综述了速殖子与缓殖子的相互转化及其可能的机制。     

弓形虫核酸（DNA）免疫系列研究

本系列研究筛选了弓形虫（Toxoplasma）速殖子表膜主要抗原（SAG1或P30）及分泌排泄抗原棒状体蛋白基因（ROPl），并将二者拼接构建复合基因（sAG1／ROP1），对其进行扩增、克隆、表达，制备真核表达质粒，接种小鼠，研究其免疫保护效应，为弓形虫核酸疫苗的研制提供有积极意义的科学根据。     

弓形虫核酸（DNA）免疫系列研究

 本系列研究筛选了弓形虫（Toxoplasma）速殖子表膜主要抗原（SAG1或P30）及分泌排泄抗原棒状体蛋白基因（ROPl），并将二者拼接构建复合基因（sAG1／ROP1），对其进行扩增、克隆、表达，制备真核表达质粒，接种小鼠，研究其免疫保护效应，为弓形虫核酸疫苗的研制提供有积极意义的科学根据。     

抗滋养细胞膜抗原( T A) Ig G 类抗体诊断原因不明性流产的临床价值

目的：探讨抗滋养细胞膜抗原（ Ｔ Ａ） Ｉｇ Ｇ 类抗体与原因不明性流产的关系。方法：采用酶联免疫吸附实验（ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ）检测９５例流产妇女及５２例正常妊娠妇女血清中抗滋养细胞膜抗原（ Ｔｒｏ ｐｈｏｂｌａｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ， Ｔ Ａ） Ｉｇ Ｇ 类抗体的水平。结果：流产妇女血清中抗滋养细胞膜抗原 Ｉｇ Ｇ 类抗体水平明显高于正常妊娠妇女（ Ｐ＜ ０００１）；流产妇女血清抗滋养细胞膜抗原 Ｉｇ Ｇ 类抗体水平与孕次呈正相关（ｒ＝ ０．９１， Ｐ＜ ００５）。结论：血清中抗滋养细胞膜抗原 Ｉｇ Ｇ 类抗体水平可以作为流产免疫因素的一个特异性的辅助诊断指标。     

恙虫病东方体56kD表达抗原基因片段的、表达及纯化抗原在恙虫抗体检测中的应用

目的：构建恙虫病东方体56kD表面抗原基因（sta56)片段的重组表达质粒，在E.coli中表达Sta56重组抗原，重组抗原纯化后应用于间接法ELISA，金标快速免疫导析法检测恙虫病东方体特异性抗体，方法：从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出sta56基因的ORF及其中长1053bp的大片段，用TA克隆技术将此大片段克隆以该重组质粒为模板，扩增出不同长度的截短的sta56片段，定向插入pPROEX HTb及pET30a载体，化大肠杆菌DH5a或BL21（DE3），IPTG诱导表达，应用SDS－PAGE观察重组蛋白表达情况，应用Western blot分析重组抗原的活性；采用电洗脱，亲和层析等方法纯化重组蛋白。纯化的重组蛋白直接包被聚乙烯96孔板，用于间接法ELISA检测恙虫病东方体IgG，或以胶体金标记重组抗原，运用金标快速免疫层析法检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体，结果：（1）从恙虫病东方体Karp株基因组中扩增出含sta56基因的ORF，并成功构建含sta56 ORF大片段的重组质粒TOPO－sta56.(2)以截短的sta56基因片段构建重组表达质粒pHTbOt957,pHTbO498,pHtbOt342和pETOt957,pETOt498,pETOt342，各重组子均可在E.coli中以融合蛋白的形式有效表达，SDS－PAGE显示各表示重组子表达不同分子量的重组蛋白，Western blot证实各重组蛋白均能被恙虫病患者阳性血清所识别。（3）电洗脱、Ni-NTA并和层析均可用于重组蛋白的纯化，并获得高纯度的重组蛋白。（4）纯化的重组蛋白应用于间接法ELISA检测恙虫病东方体特异性IgG，与间接免疫荧光法IFAT比较，其敏感性和特异性分别91．7％和76．5％。（5）纯化的重组蛋白应用于金标免疫层析法，可直接快速检测恙虫病东方体特异性IgM和IgG。与间接免疫荧光法IFAT比较，其检测IgG的敏感性和特异性分别为94．2％和84．2％，结论：恙虫病东方体Karp株sta56基因可在大肠杆菌获得高效表达。重组蛋白具有免疫反应性，纯化后可用作免疫诊断抗原；以重组抗原建立的间接法ELISA检测IgG，适用于大规模的流行病学调查，以胶体金标记重组抗原建立的免疫层析法用于同时检测IgM和IgG抗体，具有简便，快速的特点，适于在缺乏实验条件的基层医院，农村对门诊病人进行诊断。     

用ABC—Dot—ELISA检测兔弓形虫循环抗体的初步研究

应用ABC-Dot-ELISA检测感染兔弓形虫循环抗体并与ABC-ELISA检测结果进行了比较,结果表明:前者不仅具有与后者相同的敏感性、特异性及重复性,而且操作简易、快速,所需抗原量和待检血清量较少。用二法观察了6只兔于感染后3～90天内抗体的消长情况。此外,对弓形虫速殖子的纯化,可溶性抗原的制备及其在ABC-Dot-ELISA、ABC-ELISA中的应用条件进行了研究。     

刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用

目的 原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示：TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论 本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。     

蓝氏贾第鞭毛虫保护性抗原的实验研究

目的筛选蓝氏贾第鞭毛虫的保护性抗原，为免疫疫苗的研制奠定基础。方法利用已建立的蓝氏贾第鞭毛虫滋养体体外培养系统，获取滋养体抗原，并进一步分离、纯化、活性鉴定；然后分组免疫小鼠，检测相关免疫指标；再行攻击感染试验，视其抗感染能力，筛选出保护性强的抗原组分。结果成功获取5个组分的抗原蛋白（P76／66、P54／50、P34／32、P30／29和P21／19），P76／66抗原活性最强，其诱发BALB／C小鼠产生的抗体含量最高。各组分抗原免疫小鼠，产生的白细胞介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）及CD4^＋、CD8^＋ T淋巴细胞的数量均随免疫次数的增多而逐渐增加。攻击试验结果显示，P76／66抗原的免疫保护率最高为100％，其次是P21／19为65％。结论P76／66抗原具有良好的免疫保护力，为蓝氏贾第鞭毛虫免疫疫苗的研制提供了物质基础。     

细胞内外弓形虫速殖子的形态观察

目的 观察细胞内（假包囊）、外弓形虫速殖子的形态差异。方法 收集小鼠腹腔内和体外培养中的细胞内、外弓形虫，染色后镜检，观察细胞内、外弓形虫速殖子的形态差异。结果 假包囊内的速殖子明显大于细胞外的速殖子，结构疏松，近圆形和椭圆形。随着繁殖数量的增加，虫体可排列成弧形及花瓣状。结论 细胞内、外弓形虫速殖子的形态差异较大。     

常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响

目的了解常用消毒剂及自来水对弓形虫速殖子活力的影响。方法将各种消毒剂分别加入等体积含弓形虫速殖子的小鼠腹水中，在不同时间内观察虫体胎盘蓝（trypanblue）着色率及活动率，并将经消毒剂处理不同时间的速殖予接种昆明鼠，观察速殖子能否在接种鼠体内复苏繁殖，导致小鼠死亡。用类似方法观察自来水时速殖子的影响。结果除甲醛个速殖子在常用浓度的不同消毒剂中，lmin月台盘蓝着色率均为100％，活动率为0。经消毒剂处理1min的速殖子接种小鼠后，各组接种鼠（包括甲醛处理组）无一死亡。经自来水处理4h的速殖子接种小鼠后仍能在小鼠体内复苏繁殖，小鼠于接种1wk内全部死亡。结论弓形虫速殖子对常用消毒剂均很敏感；而在自来水中途殖子可保持感染力4h以上。     

金诺芬通过促进自噬对弓形虫增殖的影响

目的：金诺芬对弓形虫速殖子的作用及对弓形虫感染小鼠的自噬初步探讨。方法：透射电子显微镜观察用药前后刚地弓形虫超微结构的变化;采用免疫荧光、免疫组化和免疫印迹法检测感染有弓形虫的脑组织中自噬蛋白LC3的变化。HE染色观察金诺芬作用前后小鼠脑部的弓形虫速殖子变化。结果：透射电镜显示10 ?滋g/mL组（B组）的弓形虫速殖子内部结构被破坏,虫体细胞膜破裂,细胞质均质样改变,20 ?滋g/mL组（C组）的虫体内容物溢出,线粒体及粗面内质网消失,核固缩,核膜断裂,细胞质出现许多空泡,严重者虫体崩解呈均质样改变。免疫荧光结果显示实验组（77.49±15.68）的LC3蛋白的表达量较对照组（53.81±15.24）明显增加（P=0.001）。免疫组化结果显示用药后（1 208.55±580.07）的LC3蛋白表达量比对照组（544.54±225.04）明显增高（P=0.000）。免疫印迹法检测结果显示用药后（41 738.52±0.00）的LC3蛋白表达量比对照组（25 383.88±607.34）明显增高（P=0.000）。用药后（218.80±21.17）寄生在小鼠脑部的弓形虫速殖子增殖数量明显少于对照组（495.40±31.91）（P=0.000）。结论：金诺芬在体外有破坏弓形虫速殖子的作用,同时金诺芬可以提高弓形虫感染小鼠的自噬水平从而抑制弓形虫增殖。     

滋养叶细胞疾病II型类固醇受体对增生和恶性转化的临床…

对２２８例正常、良性和恶性滋养叶细胞疾病检测Ⅱ型类固醇受体，并与表皮样生长因子、核增殖抗原、癌胚抗原相比较。结果示：（１）３种Ⅱ型类固醇受体与增生性指标ＥＧＦＲ和ＦＣＮＡ呈相关性表达（ｒ〉０．６），但滋养叶细胞变为恶性去分化时Ⅱ型类固醇受体减弱表达，ＥＧＦＲ和ＦＣＮＡ则与ＣＥＡ表现相关性增加表达；（２）Ⅱ型类固醇受体主要在早妊和滋养叶细胞疾病的ＣＴ和ＩＴ细胞表达，提示它们的临床增生意义；（３）３种     

对嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型重组env的研究

目的探讨人类嗜T淋巴细胞病毒（Human T-cell Lymphotropic Virus,HTLV）I型重组env抗原的表达。方法分析和选择HTLV-I env目的基因,将目的基因片段分别克隆入原核表达载体pQE80L,PCR和酶切鉴定重组子,诱导并亲和层析纯化表达重组env蛋白抗原,Western-blot检测重组env蛋白抗原活性,ELISA方法测试重组env蛋白抗原的特异性。结果 PCR扩增和酶切筛选得到阳性重组子pQE80L-env。SDS-PAGE显示重组蛋白相对分子质量约为25KDa,与预期分子量相符。免疫印迹在约25KDa有一明显特异印迹条带。转染细胞培养48h,SDS-PAGE分析,有相对分子质量约为27KDa目的重组蛋白表达,与预期的融合蛋白大小相符。ELISA检测到正常人、HIV阳性和HTLV-II阳性的参考血清均为阴性;HTLV-I阳性的参考血清为强阳性。结论 HTLV-I env基因5915nt-6545nt区,可以利用原核系统表达得到特异性HTLV-I重组抗原,重组抗原无显著性差异,有望成为检测试剂的抗原。     

滋养叶细胞疾病Ⅱ型类固醇受体对增生和恶性转化的临床意义

对２２８例正常、良性和恶性滋养叶细胞疾病检测Ⅱ型类固醇受体，并与表皮样生长因子、核增殖抗原、癌胚抗原相比较。结果示：（１）３种Ⅱ型类固醇受体与增生性指标ＥＧＦＲ和ＰＣＮＡ呈相关性表达（ｒ＞０．６），但滋养叶细胞变为恶性去分化时Ⅱ型类固醇受体减弱表达，ＥＧＦＲ和ＰＣＮＡ则与ＣＥＡ表现相关性增加表达；（２）Ⅱ型类固醇受体主要在早好和滋养叶细胞疾病的ＣＴ和ＩＴ细胞表达，提示它们的临床增生意义；（３）３种Ⅱ型类固醇受体对ＣＴ和ＩＴ细胞有阳性选择性表达，而ＳＰ１对ＳＴ细胞有阳性选择性。     

弓形虫虫体抗原制备的研究

利用玻璃纤维丝柱过滤感染弓形虫ＣＦＷ小鼠的腹腔注，分离纯化速殖子，滤前平均纯度为０．７０３６±０．１６４，滤后平均纯度为０．９８７４±０．０１４。研究结果显示用此法分离纯化的速殖子，其毒力与抗原性均不发生改变。     

前列腺特异性抗原的临床应用价值

目的：总前列腺特异性抗原（tPSA）和游离前列腺特异性抗原（fPSA）在前列腺癌良、恶性的鉴别诊断上无明显差别,然而比较良、恶性活检组的游离前列腺特异性抗原（fPSA）与总前列腺特异性抗原（tPSA）的比值（％fPSA均值）发现在前列腺良、恶性病变鉴别诊断有着显著地差别。方法：使用罗氏E601和罗氏E411电化学发光免疫分析仪及其配套试剂总前列腺特异性抗原（PsA）定量试剂盒、游离前列腺特异性抗原测定试剂盒检测总前列腺特异性抗原和游离前列腺特异性抗原并且计算出游离前列腺特异性抗原（fPSA）与总前列腺特异性抗原（tPSA）的比值（％fp-SA均值）。结果：总前列腺特异性抗原在前列腺癌良、恶性的鉴别诊断上无明显差别;游离前列腺特异性抗原也在前列腺癌良、恶性的鉴别诊断上无明显差别,而游离前列腺特异性抗原（fPSA）与总前列腺特异性抗原（tPSA）的比值（％fPSA均值）在前列腺癌良、恶性的鉴别诊断上有明显差别。结论：游离前列腺特异性抗原（fI）SA）与总前列腺特异性抗原（tPSA）的比值（％fPSA均值）在前列腺良、恶性病变鉴别诊断有显著地差别。