变异型IκBα抑制人类多形性胶质母细胞瘤细胞中血管生长因子VEGF及IL-8的表达

目的探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform,GBM)的细胞生长及其内血管内皮成长因子(VEGF)、白细胞介素-8(IL-8)表达的调控作用。方法通过构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达的筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株,进而检测转染后细胞的体外生长曲线,并运用Northern blot技术分析细胞内VEGF、IL-8在RNA水平的表达。结果用Western blot法成功筛选了转染的阳性细胞克隆,并发现转染后的人类GBM细胞与对照相比,体外生长曲线无明显差异,但其中VEGF、IL-8在RNA水平的表达量显著降低。结论IκBαM基因对人类GBM细胞中的血管生长因子VEGF、IL-8的表达具有抑制作用。     

胶质瘤中变异型IκBα的表达与抑制肿瘤浸润的研究

目的 探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type PA,uPA)和其受体(uPA-receptor,uPAR)表达的调控作用及其与肿瘤浸润行为的关系.方法 构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株;用Transwell法测定肿瘤细胞的迁移能力;RT-PCR技术检测细胞内uPA、uPAR在RNA水平的表达;制作裸鼠皮下异位移植瘤生长模型,并采用免疫组化法分析肿瘤组织中uPA和uPAR的表达.结果 Transwell法测定G36△-M组肿瘤细胞的迁移能力明显降低;RT-PCR及肿瘤组化染色结果显示,uPA和uPAR在G36△-M组中的表达显著低于G36△、G36△-W和G36△-P三组,而在后三组间的表达无统计学意义.结论 IκBαM基因在RNA和蛋白水平均可显著降低人类恶性胶质瘤中uPA和uPAR的表达,进而减弱肿瘤细胞的浸润能力,抑制肿瘤组织的浸润.     

脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制真核表达载体构建及最佳短发夹样RNA分子筛选

目的构建并筛选大鼠胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达抑制短发夹样RNA（shRNA）真核表达载体。方法针对GFAP基因全编码序列设计并合成三对9bp茎环结构、19bp干扰序列特异性shRNA模板，体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体；通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型，脂质体介导RNA干扰分子转染，实时荧光定量RT—PCR及Wesem blot技术观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果．筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。结果序列测定证实GFAP—shRNA重组质粒真核表达载体构建成功，三对shRNA模板在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81％、63％、56％。结论高效率的GFAP—shRNA真核表达载体在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP基因表达，为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗中的应用奠定了前期基础。     

RhoE表达上调对U87细胞NF-κB活性的影响

目的探讨RhoE对转录因子NF-κB活性水平的影响。方法将包含RhoE基因的质粒转染胶质瘤U87细胞;免疫印迹实验分析NF-κB亚单位p65在胞浆和胞核中的蛋白表达水平;细胞免疫化学实验检测p65在细胞中的蛋白表达水平和亚细胞定位;免疫印迹实验检测Ikkβ和IκBα蛋白表达水平。结果将pC MVFlA G-RhoE质粒成功转染U87细胞后,免疫印迹实验显示,胞浆和胞核中p65的蛋白表达水平均较对照组下降;细胞免疫化学结果亦表明,p65在细胞核中的定位量明显减少。免疫印迹实验进一步分析显示,NF-κB上游调控分子IκBα表达增加,而Ikkβ表达减少。结论上调RhoE表达水平能够抑制U87细胞转录因子NF-κB活性水平。NF-κB活性的降低可能与RhoE调控Ikk/IκBα机制相关。     

载脂蛋白E影响星形胶质细胞基质金属蛋白酶-9表达的机制研究

目的探讨载脂蛋白E(Apo E)影响星形胶质细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的机制。方法(1)体外培养C57BL/6J种属的野生型(WT)和Apo E基因敲除型(Apo E-/-)乳鼠的星形胶质细胞,利用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体行免疫荧光染色鉴定星形胶质细胞。(2)将WT和Apo E-/-乳鼠星形胶质细胞分别分为空白对照组(Control组)、阴性对照组(NC组)和阳性沉默组(KD组),Control组不加任何病毒,NC组加入阴性对照慢病毒,KD组加入沉默p65基因的阳性慢病毒,用siRNA慢病毒沉默星形胶质细胞核因子-κB(NF-κB) p65基因,抑制NF-κB信号转导,应用Western blot检测NF-κB p65蛋白的表达,ELISA法检测细胞MMP-9和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。(3)用TNF-α刺激上述各组细胞24h,ELISA法检测刺激前后各组细胞MMP-9的浓度。结果(1) KD组两种细胞NF-κB p65蛋白的表达水平、MMP-9和TNF-α的浓度均显著低于Control组和NC组(P 0. 05);而Control组和NC组细胞NF-κB p65蛋白的表达水平、MMP-9和TNF-α的浓度间的差异无统计学意义(P 0. 05)。(2) Apo E-/-细胞MMP-9和TNF-α的浓度在Control组和NC组中均高于WT细胞(P 0. 05);而在KD组中与WT细胞无明显差异(P0. 05)。(3) TNF-α刺激24h后,Control组和NC组两种细胞MMP-9的浓度均升高(P 0. 05);而KD组MMP-9的浓度无明显变化(P 0. 05)。结论 Apo E可能通过TNF-α/NF-κB信号通路影响星形胶质细胞MMP-9表达,从而影响血脑屏障的完整性。     

NF-κB、IκB、GFAP在脊髓空洞前状态中的表达和作用

目的:脊髓空洞前状态主要表现为脊髓缺血缺氧性水肿,为了探讨其发生的分子生物学机制,观察脊髓组织中的NF-κB、IκB、VEGF、GFAP的表达,探讨它们之间的相互关系。方法:通过枕大池注射Kaolin制作家兔的脊髓空洞症模型,应用免疫组织化学的方法测定不同时间点的脊髓组织中NF-κB、IκB、VEGF、GFAP的表达。结果:Kaolin组动物颈髓组织中,NF—κB表达在术后第1天明显升高,第3天达到高峰,两周时基本恢复正常;IκB各时间点的表达变化与NF-κB成负相关,术后第1天开始明显下降,维持低水平表达至第7天;VEGF主要表达于神经元,神经胶质和血管内皮细胞的胞浆中,术后第1天表达明显增高,第7天达到高峰且维持两周,第3周表达明显减弱,但仍高于正常。GFAP则主要表达于神经胶质细胞,于术后第1天开始升高,但高峰期较VEGF向后延迟至两周并维持到三周仍呈较高水平。结论:在脊髓空洞前状态中,VEGF表达增高,影响BBB的完整性,产生脊髓水肿:GFAP表达增高,代表脊髓组织增强的神经胶质反应。他们二者的高表达同时受NF—κB/IκBα的活性的调节。     

美满霉素抑制血管性认知功能损伤大鼠海马星型胶质细胞激活和神经炎症(英文)

目的观察美满霉素(minocycline)对血管性认知功能损伤大鼠海马组织GFAP、COX-2、NF-κB、IL-1β和TNF-α表达的影响,探讨美满霉素对血管性认知功能损伤脑保护作用的机制。方法Wistar大鼠随机分为假手术组(S组)、血管性认知功能损伤模型组(M组)和美满霉素治疗组(MT组)。免疫组织化学法检测大鼠海马组织COX-2和NF-κB的表达,蛋白质印迹和免疫组织化学法检测大鼠海马组织GFAP的表达,ELISA法检测大鼠海马组织IL-1β和TNF-α的表达。结果MT 组 GFAP、COX-2、NF-κB、IL-1β和 TNF-α表达较 M 组均降低(P<0.01) ;MT 和 M 组GFAP、COX-2、NF-κB、IL-1β和 TNF-α表达均显著高于 S 组(P<0.01)。结论美满霉素能降低血管性认知功能损伤大鼠海马组织中GFAP、COX-2、NF-κB、IL-1β和TNF-α的表达,抑制血管性认知功能损伤大鼠海马星型胶质细胞活化和神经炎症,发挥脑保护作用。     

小胶质细胞内核因子-κB对靶基因的转录调节

小胶质细胞是脑内重要的常驻免疫效应细胞，激活后可释放多种细胞因子参与神经系统损伤及疾病的早期免疫应答。核因子-κB（NF-κB）是真核细胞内的一种快反应核转录因子，在神经系统中广泛表达。小胶质细胞胞浆内的NF-κB激活后通过核移位，与胞核DNA上的炎症相关基因特异结合从而调节炎症因子的基因表达。阻断NF-κB中介的炎症反应可能成为CNS炎症相关疾病的治疗靶点。     

《中国神经免疫学和神经病学杂志》2007年第14卷文题索引

基础研究新斯的明试验改良结果判定法研究.彭丹涛等,14:1APP17肽对APP转基因小鼠学习记忆能力和海马神经细胞凋亡的影响.杜怡峰等,14:7BDNF及其受体TrkB在实验性癫痫中的作用及意义探讨.林卫红等,14:11GFAP特异性启动IκBα突变型基因真核表达载体的构建和鉴定.祝畅等,14:14依达拉奉对脑缺血再灌注后FADD、caspase-8表达的影响.胡跃强等,14:20局部亚低温对大鼠大脑中动脉闭塞后神经元凋亡的影响.张艳等,14:23神经生长因子对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学评价.杨冀萍等,14:28PDTC对MPTP帕金森病鼠黑质NF-κB…     

NF-κB与脑缺血

核转录因子NF-κB(Nuclear factor kappa-B)于1986年被发现，因其能与免疫球蛋白-i链基因上的增强子结合，故得此名。起初人们认为NF-κB仅在B细胞中表达，后来发现几乎所有类型细胞中都有其存在．在神经系统中，NF-κB广泛分布于神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。在静息状态下，NF-κB与其抑制因子IκB(Inhibitor of nuclear factorkappaB)结合成复合物存在于细胞浆中，     

表皮生长因子介导成胶质瘤细胞NF-κB核转位的机制初探

目的 研究表皮生长因子(EGF)调节成胶质细胞瘤细胞内核因子-κB(NF-κB)核转位的可能机制. 方法 电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测激活和抑制磷脂酶C-γ1(PLCγ1)后,成胶质细胞瘤U-87MG中NF-κB的核转位水平,随后采用免疫印迹法(Western Blot)检测蛋白激酶C-α(PKCα)的表达水平,继而检测激活和抑制PKCα后NF-κB的核转位水平. 结果 NF-κB核转位水平在EGF刺激60 min时达最大值,而经PLCγ1特异性抑制剂U-73122提前处理后,刺激后同期却无明显改变;在PKC特异性激动剂佛波酯(PMA)刺激后60 minNF-κB核转位水平达高峰,而提前使用PKCα特异性抑制剂Ro 31-8220处理细胞可有效逆转此改变. 结论 EGF可能通过PLCγ1-PKCα信号通路介导NF-κB向核内转位,从而调控相关侵袭和转移基因的转录.     

PINK1介导缺氧损伤时星形胶质细胞对神经元的保护作用

目的探究星形胶质细胞内PTEN诱导假定激酶1(PINK1)缺失对缺血时神经保护作用的影响及其作用机制。方法离体培养原代星形胶质细胞,使用小干扰RNA(si RNA)沉默PINK1表达,氧糖剥夺(OGD)建立细胞缺氧模型,分为4组:PINK1沉默组(si RNA+转染剂)、空质粒组(空质粒+转染剂)、转染剂组(只加转染剂)和对照组(星形胶质细胞),各组均与神经元共培养;另设立神经元单独培养组。免疫荧光染色观察神经元凋亡情况。定量PCR及ELISA检测星形胶质细胞促红细胞生成素(EPO)及血管内皮生长因子(VEGF)表达量;Western blot检测星形胶质细胞内缺血诱导因子(HIF)及核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白水平。结果 OGD损伤后神经元凋亡率较高,与星形胶质细胞共培养后神经元凋亡率显著降低(P0.05)。PINK1基因沉默后共培养神经元凋亡增加,星形胶质细胞EPO及VEGF分泌量减少、胞内EPO及VEGF转录水平降低(P0.05);HIF-1、HIF-2与NF-κB通路活化水平均显著降低(P0.05)。结论星形胶质细胞对OGD损伤神经元有保护作用,其作用通过EPO及VEGF实现;PINK1基因沉默后星形胶质细胞对缺血神经元保护作用减弱,可能与NF-κB通路活化水平降低、HIF激活受损进而下调EPO和VEGF表达量有关。     

重组腺病毒AdIκBaM对局灶缺血脑组织的保护作用研究

核转录因子-κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)是由两个亚单位P65和P50组成的异二聚体核转录因子,它与其抑制因子IκB结合存在于细胞质中。当细胞受到外界刺激时,IκB激酶活化,抑制因子IκB被其降解,NF-κB被激活并移入细胞核进而调控一系列基因的表达[1]。IκB存在同型异构体,其中IκBα是NF-κB最重要的抑制因子。研究表明,ser32、ser36发生突变的IκBα不会被IκB激酶降解,而与NF-κB发生不可逆性结合,从而抑制其激活[2]。用NF-κB特异抑制因子IκBαM抑制其激活可避免其他影响因素的干扰,从而更确切地反映NF-κB在局灶…     

稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-突触核蛋白单克隆SH-SY5Y细胞株的建立

目的利用分子克隆技术构建含人野生型(WT)及致病突变A30P(G88C)、A53T(G157A)α-突触核蛋白基因(α-synuclein gene,SNCA)的重组真核表达载体pLentiVENUS-YFP-SNCA,通过慢病毒转染的方法获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein单克隆SH-SY5Y细胞株。方法提取红白血病细胞K562细胞总RNA,以RT-PCR法扩增SNCA,SNCA与克隆载体PMD-19T的体外连接(T-A克隆)后进行基因测序,将测序正确者以限制性内切酶酶切后与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立野生型重组真核表达载体。取正常SNCA与克隆载体连接体,利用单核苷酸差异引物定点突变法构建SNCA的两个突变型A30P、A53T,经基因测序、酶切与真核表达载体pLentiVENUS连接,建立突变型的重组真核表达载体。以磷酸钙沉淀法转染293T细胞制备的慢病毒转染SH-SY5Y细胞,利用流式细胞仪BD AriaⅢ进行96孔板单细胞分选以获得稳定过表达人野生型及致病突变型A30P、A53Tα-突触核蛋白的单克隆细胞株,并通过倒置荧光显微镜、蛋白免疫印迹、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,Rt-PCR)、鉴定各单克隆SHSY5Y细胞株是否过表达。结果 Rt-PCR及电泳结果显示所获得目的基因,基因测序结果正确;重组真核表达载体pLentiVENUS-SNCA经限制性内切酶酶切和基因测序证明构建成功。倒置荧光显微镜显示除对照组(未转染组)外,空载体转染组及载体与SNCA重组后转染组均有荧光蛋白表达;但蛋白免疫印迹结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的蛋白含量高于空载体组。RT-PCR结果显示载体与正常或突变的SNCA重组后转染组的细胞RNA表达量高于空载体组。结论利用分子克隆技术和慢病毒转染技术成功建立过表达α-突触核蛋白的WT及A53T、A30P突变型SH-SY5Y单克隆细胞株。     

中枢神经系统中星形胶质细胞活化机制的研究进展

星形胶质细胞在中枢神经系统(CNS)中含量丰富,对神经元起着支持、营养、修复等多种重要作用。在CNS损伤或外源性物质作用时,星形胶质细胞发生活化。JAK-STAT3、核因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、TGF-β/Smad等多条信号通路共同作用,调节星形胶质细胞内相应基因的转录与表达。探究星形胶质细胞活化的机制,对深入理解CNS疾病的发生发展有着重要意义,但这一领域研究仍有许多未知与不足。文中综述近年CNS中星形胶质细胞活化机制的研究进展,阐述星形胶质细胞活化的可能机制,以期对该领域研究做归纳总结并为将来的研究提供新的依据和方向。     

Hax-1对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用

目的 探讨造血干细胞特异性相关结合蛋白-1（Hax-1）对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 选择2018年9月至2019年6月手术切除并得到术后病理证实的胶质瘤组织35例和颅脑损伤内减压术切除的正常脑组织35例,采用qRT-PCR检测Hax-1 mRNA水平;同时检测胶质瘤细胞系（U87、A172、T98及U343）和人星形胶质细胞（NHAs）Hax-1 mRAN水平。使用Lipofectamine 2000法将Hax-1 siRNAs和阴性对照siRNA转染U87细胞构建Hax-1低表达细胞株,将Hax-1高表达质粒和PCDNA3.1空载质粒转染U343细胞构建Hax-1过表达细胞株,使用蛋白印迹法验证转染效果,采用CCK-8法检测细胞增殖,采用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白表达水平（NF-κB、CCND1、C-myc、MMP-2、MMP-9）。结果 胶质瘤组织Hax-1 mRNA水平明显高于正常脑组织（P<0.05）;胶质瘤细胞系（U87、A172、T98及U343）Hax-1 mRNA水平明显高于人星形胶质细胞（P<0.05）,其中U87细胞Hax-1 mRNA水平最高,U343细胞最低。U343细胞转染Hax-1过表达质粒后,Hax-1蛋白水平显著增高（P<0.05）,细胞增殖、侵袭、迁移能力均明显增强（P<0.05）,NF-κB p65及IκBα蛋白磷酸化水平以及CCND1、C-Myc、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显增高（P<0.05）。U87细胞转染Hax-1 siRNA后Hax-1蛋白水平显著降低（P<0.05）,细胞增殖、侵袭、迁移能力均明显降低（P<0.05）,NF-κB p65及IκBα蛋白磷酸化水平以及CCND1、C-Myc、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤组织Hax-1呈高表达,明显促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能与激活NF-κB信号通路有关。     

能合成和分泌GABA的永生化星形胶质细胞的构建

目的 构建能合成和分泌GABA的永生化星形胶质细胞。方法 在原代培养的大鼠星形胶质细胞内转入猴肾病毒40大T抗原基因（si mian virus40large T antigen gene，SV40Tag）使其永生化（这一部分由同济医院麻醉科田玉科教授实验室完成），并在这些细胞内转入含谷氨酸脱羧酶65亚型（glutamate decaxrboxylase65，GAD65）目的基因质粒，对照组转染含β-gal（β-半乳糖苷酶，对照质粒）质粒；应用免疫组化及Western-blot方法检测转染后细胞内GAD65的表达水平；应用毛细管电泳法检测这些细胞内外的氨基丁酸（GABA）含量；用全细胞膜片钳记录构建细胞的GABA电流。结果 与转染β-gal的对照组比较，转染GAD65的实验组细胞在具备胶质细胞特性之外，能稳定表达GAD65，细胞内的GAD65含量明显增加；同时细胞内的GABA含量明显高于对照组；实验组细胞外液GABA的浓度明显高于对照组；实验组和对照组均能记录到GABA电流，说明构建细胞功能完善。结论 永生化的星形胶质细胞中转入GAD65质粒后具备胶质细胞特性，构建细胞能稳定表达GAD65，并且能合成和分泌GABA。     

疏血通对凝血酶诱导培养的星形胶质细胞损伤的保护作用

目的探讨疏血通对凝血酶诱导培养的星形胶质细胞损伤的保护作用。方法采用体外培养星形胶质细胞的方法,对新生Wistar大鼠大脑星形胶质细胞进行培养并纯化,用不同浓度的疏血通作用后,然后根据需要加入凝血酶干预。用免疫细胞化学染色和逆转录多聚酶链反应(RTPCR)检测培养星形胶质细胞NFκB蛋白和基因的表达;用化学反应法测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶活性(LDH);MTT法观察细胞生长活性的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡的变化。结果疏血通下调凝血酶作用下的体外培养星形胶质细胞上NFκB的表达;使细胞生长活性明显增加;减轻细胞G2/M期的阻滞,凋亡比例下降。结论疏血通减轻凝血酶诱导培养星形胶质细胞的损伤,可能通过其抗细胞凋亡作用。