黄胸鼠微卫星分子标记的筛选

目的研究黄胸鼠不同地理区域种群的遗传差异,用磁珠富集法筛选其微卫星位点。方法将黄胸鼠基因组DNA用限制性内切酶消化后的小片段与接头连接,再用生物素标记的(AC)15重复序列探针与酶切片段杂交,应用链霉素亲和磁珠捕获300～600bp含有微卫星序列的DNA片段,通过载体转化到JM109感受态细胞中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,测序后设计引物并筛选。结果本次实验从约900个转化子中获得304个阳性克隆,对其中140个进行测序,并成功设计黄胸鼠微卫星引物13对。结论筛选出的13对微卫星引物多态性高,能稳定扩增出目标条带,可用于种群遗传研究。     

四川光壳钉螺微卫星遗传变异的小尺度空间自相关分析

目的 采用小尺度空间自相关分析方法对四川省普格县的湖北钉螺自然居群微卫星(SSR)遗传变异的空间结构进行分析,探讨湖北钉螺自然居群遗传变异的空间分布特征.方法 选用5对SSR引物对湖北钉螺基因组DNA进行扩增,选择频率在15%～85%的72个SSR等位基因,运用等样本对频率方法划分14个距离等级分别计算空间自相关系数Moran's I,.结果 5对SSR引物经PCR扩增共得到274个等位基因,SSR等位基因的平均多态信息量高达0.965,表现出很高的遗传多态性.钉螺种群中39个SSR等位基因的遗传变异存在一定程度的空间结构,表现为不同模式的正空间自相关.根据这39个等位基因在14个距离等级上的平均Moran's I值,可以发现随着距离增大正空间自相关性逐渐减小,但未发现表现为负空间自相关的距离等级和等位基因.结论 普格县湖北钉螺种群中SSR遗传变异的空间分布,表现为随着距离增加而减少的正空间自相关性.     

滇西南地区埃及伊蚊种群微卫星标记筛选研究

目的研究滇西南地区埃及伊蚊种群遗传学特征,针对该地区的埃及伊蚊种群筛选新的微卫星位点。方法从美国国立生物技术信息中心Gen Bank数据库中下载埃及伊蚊全基因组数据,利用Tandem Repeats Finder软件查找全基因组中的微卫星位点,选择重复单位为2~4 bp且重复次数30的微卫星位点,对其侧链进行BLAST比对,选择在基因组中单拷贝的位点设计引物,再对引物进行BLAST比对,选择扩增产物为单拷贝的引物进行相关筛选。结果从17个全基因组中共获得80条微卫星序列,并成功设计出11对多态性引物,核心序列包括5对2碱基重复,5对3碱基重复以及1对4碱基重复,共有98个等位基因,平均每对引物有9个等位基因,观察杂合度平均值为(0.394±0.026)。结论设计引物可稳定地扩增出目标条带,且多态性较高,可以用于埃及伊蚊的种群遗传学研究。     

用分子生物学技术诊断巴尔通体感染

目的 应用聚合酶链反应(PCR)技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者。方法 根据16S～23S rRNA ITS基因序列较其他属细菌长,而且位于这段基因序列中的tRNA~(Ile)-tRNA~(Ala)基因间隔区具有高度变异性,tRNA~(Ile)和tRNA~(Ala)基因序列在巴尔通体属中完全保守,设计引物;同时应用文献发表的2对引物直接扩增1例临床可疑猫抓病患者全血基因组DNA。将研究设计引物的PCR产物直接测序,并进行序列分析。结果 3对引物扩增全血基因组DNA均获得巴尔通体特异基因片段,根据其中2对引物扩增产物大小与阳性对照不同,可初步确定样本与阳性对照菌株是不同巴尔通体;序列分析结果显示,研究设计引物TIle.455p-TAla.885n扩增产物核苷酸序列与中国云南省巴尔通体-分离株对应位置的序列相一致,同源性100％。结论 应用PCR技术从血液中直接扩增特异基因片段,可以快速检测巴尔通体感染;测序及序列分析结果进一步提供了此种致病巴尔通体在中国南北方均存在的线索。     

微卫星锚定PCR分析19个湖北钉螺种群之间的遗传变异关系

目的探讨湖北钉螺种群间的遗传变异关系。方法采用微卫星锚定PCR分子标记技术对来自中国大陆8个省的19个种群钉螺基因组DNA进行扩增，分析钉螺各种群间的遗传变异并对钉螺种群进行聚类分析。结果19个钉螺种群间的遗传距离D在0～0．73之间，平均遗传距离D为0．22±0．013。19个钉螺种群被聚成4类，一类包括分布在长江中下游流域（湖南、湖北、江西、安徽、江苏）的16个钉螺种群；广西宜州、福建福清和云南大理的钉螺种群分别单独成一类。结论目前分布在中国大陆的湖北钉螺可能分为4个亚种，即指名亚种、滇川亚种、福建亚种、广西亚种。     

25个湖北钉螺种群扩增片段长度多态性分子标记的遗传变异研究

目的探讨湖北钉螺种群间的遗传变异及其程度。方法采用扩增片段长度多态性分子标记技术对来自中国大陆10省的25个种群钉螺基因组DNA样品池进行扩增，分析钉螺各种群间的遗传变异并对钉螺种群进行聚类分析。结果25个钉螺种群间的相似系数GSDICE在0．694～0．831之间，Nei无偏遗传一致性在0．635～0．799之间，遗传距离D在0．169～0．306之间，Nei无偏遗传距离在0．225～0．452之间，光壳钉螺种群间的遗传变异程度明显高于肋壳钉螺种群间的遗传变异程度（P〈0．01）。25个钉螺种群被聚成3类，A类包括来自福建福清和广西宜州的光壳钉螺种群；B类包括来自四川西昌、普格、丹棱、蒲江、广汉和云南大理的光壳钉螺种群；C类则由其他来自长江中下游地区的17个钉螺种群组成。结论在中国分布的湖北钉螺已发生较大的遗传变异，基因组水平上的钉螺种群聚类结果和其地理分布基本一致。     

志贺菌诱导耐药相关基因序列分析

目的获取并分析志贺菌由抗生素诱导产生的耐多药相关基因序列。方法以志贺菌敏感株(Z23)和诱导株(YD)基因组DNA为模板,利用引物设计软件Primer 5.0根据已测得基因序列(Y16B3、Y16B8和Y16A11)设计引物,PCR扩增诱导耐多药相关基因并将相关基因克隆到pMD19-T载体上,测序并将结果在序列相似性搜索工具Blast上检索分析相关基因序列。结果Y16B3和Y16B8基因片段分别在诱导株中扩增出320和225 bp产物,在敏感株中未扩增出;而Y16A11基因片段在诱导株扩增出310 bp产物,在敏感株中扩增出554 bp产物,并且产物序列同源性极低。结论志贺菌在抗生素诱导下产生的耐多药株与敏感菌株比较,具有基因组差异。     

东北部分地区蜱传埃立克体DNA的检测

目的 了解东北部分地区一些蜱种中是否携带埃立克体。方法 应用16SrRNA基因构建的特异性引物进行半套式PCR,检测蜱标本中埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和序列测定,与基因库中已知序列进行同源性比较。结果从辽宁清原和吉林抚松、和龙、敦化、珲春的全沟硬蜱(Lpersuleatus)和森林革蜱(D．silvarum)中均扩增出了查菲埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库M73222)相对应片段完全一致,同源性为100％;另外从吉林抚松、珲春的全沟硬蜱中扩增出了粒细胞埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库U02521)相对应片段相差2个碱基,同源性为99.7％。结论 发现东北部分地区存在埃立克体病的病原学迹象,提示该地区可能存在埃立克体病的自然疫源地。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

阿萨希丝孢酵母cph1基因DNA序列分析

目的明确阿萨希丝孢酵母菌(TAS)是否存在与菌丝形成调控相关的cph1基因,分析其核苷酸序列,为进一步对其功能研究奠定基础。方法用简易微量DNA提取方法从TAS中提取细胞总DNA,根据GenBank中白色假丝酵母菌(CAL)cph1基因设计多对引物,PCR方法扩增,纯化后用ABI377核苷酸测序仪对扩增产物进行克隆测序,并对测序结果进行分析。结果在29对引物中只有1对引物从TAS中扩增出长度为827 bp的基因片段,BLAST分析表明与CAL cph1基因的同源性为97.3%。结论本实验首次明确TAS cph1基因中的827个碱基序列,为进一步对该基因全序列的分析及功能研究奠定了基础。     

氯代水杨胺对山丘钉螺实验室和现场杀螺效果研究

目的观察新型灭螺药10％氯代水杨胺可湿性粉剂（LDS）对浙江省山丘地区钉螺和有螺环境的灭螺效果,为现场推广应用提供科学依据。方法采用浓度0．1、0．2、0．4、0．6、0．8mg／L的LDS分别进行实验室和现场浸杀法灭螺,采用浓度0．2、0．4、0．6、0．8、1．0g／m。的LDS分别进行实验室喷洒法、现场喷洒法和撒粉法灭螺,同时设50％氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂（WPN）药物对照和清水对照,观察药物的灭螺效果。结果室内和现场浸杀试验LDS0．1mg／L浓度组,浸杀1d钉螺死亡率分别达100％和95％以上,与WPN药物对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;室内喷洒灭螺LDS0．8g／m2浓度组,喷洒1d钉螺死亡率〉95％,现场喷洒灭螺LDS0．2g／m2浓度组,喷洒3d钉螺死亡率〉85％,现场撒粉灭螺LDS0．4g／m2浓度组,撒粉后1d钉螺死亡率〉85％。各LDS试验组钉螺死亡率随着药物浓度的升高和作用时间的延长而升高。结论10％LDS对浙江省山丘地区钉螺和有螺环境具有较好的灭螺效果。     

Frequency and distribution of simple and compound microsatellites in forty-eight Human papillomavirus (HPV) genomes

Simple sequence repeats (SSRs) are tandem-repeated sequences ubiquitously present but differentially distributed across genomes. Present study is a systematic analysis for incidence, composition and complexity of different microsatellites in 48 representative Human papillomavirus (HPV) genomes. The analysis revealed a total of 1868 SSRs and 120 cSSRs. However, four genomes (HPV-60, HPV-92, HPV-112 and HPV-136) lacked any cSSR content; while HPV-31 accounted for a maximum of 10 cSSRs. An overall increase in cSSR% with higher dMAX was observed. The SSRs and cSSRs were prevalent in coding regions. Poly(A/T) repeats were significantly more abundant than poly(G/C) repeats possibly due to high (A/T) content of the HPV genomes. Further, higher prevalence of di-nucleotide repeats over tri-nucleotide repeats may be attributed to instability of former because of higher slippage rate. An in-depth study of the satellite sequences would provide an insight into the imperfections and evolution of microsatellites.     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

Genome-wide scan for analysis of simple and imperfect microsatellites in diverse carlaviruses

An exhaustive compilation and analysis of incidence, distribution and variation of simple sequence repeats (SSRs) in viruses are required to understand the evolution and functional aspects of repetitive sequences. Present study focuses on the analysis of SSRs in 32 species of carlaviruses. The full length genome sequences were assessed from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.-gov/) and analyzed using IMEx software. Variance in incidence of SSRs was observed, independent of genome size. Though the conversion of SSRs to imperfect microsatellite or compound SSR is low; compound microsatellites constituted by variant motifs accounted for up to 12.5% of the SSRs. Mononucleotide A/T is most prevalent followed by dinucleotide GT/TG and trinucleotide AAG/GAA in these genomes. The SSR and cSSR are predominantly localized to the coding region RDRP (RNA dependent RNA polymerase) and ORF-6 (open reading frame). The relative frequency of different classes of simple and compound microsatellites has been highlighted in accordance with the biology of carlavirus. Characterization of such variations would be pivotal for deciphering the enigma of these widely used, but incompletely understood sequences.     

Microsatellite markers in Triatoma pseudomaculata (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae), Chagas' disease vector in Brazil.

Six polymorphic microsatellite loci were isolated and characterized using a microsatellite-enriched genomic library from the Chagas' disease vector Triatoma pseudomaculata. This species is found in Brasil in Caatinga areas and predominantly in peridomestic habitats. All the microsatellites tested on a population of T. pseudomaculata sampled in the Bahia State, Brazil, were polymorphic (2-15 alleles). Markers amplification was also tested on six Triatoma species and some loci successfully amplified in the most phylogenetically related species, in particular Triatoma brasiliensis.     

基于微卫星标记的中国南方沿海地区白纹伊蚊种群遗传多样性研究

目的 应用微卫星标记分析中国南方沿海地区白纹伊蚊种群的遗传多样性，为媒介生物控制提供依据。方法 利用微卫星位点对浙江省杭州市、义乌市和宁波市、福建省龙岩市、广东省广州市、广西壮族自治区南宁市、海南省海口市7个采样点的白纹伊蚊种群进行了遗传多样性检测和聚类分析。结果 共检测微卫星位点7个，各个群体的等位基因数（N_A）为5.429~7.571，有效等位基因数（N_E）为2.897~3.632，等位基因丰度（R_S）为5.236~7.170，期望杂合度（H_E）为0.538~0.637。各个群体近交系数（F_IS）为0.008~0.332，表现为群体内杂合子不足，群体间分化系数（F_ST）为0.058，表明7个白纹伊蚊种群间的遗传变异为5.8%。邻接法聚类分析表明，浙江省杭州市和义乌市的白纹伊蚊种群构建成为1个分支，福建省和广东省的白纹伊蚊种群构成1个分支，广西壮族自治区和海南省的白纹伊蚊种群构成1个分支，且海南种群显示出较大的遗传变异。白纹伊蚊种群贝叶斯分支分析表明，可能的分支数为3个。结论 中国南方沿海7个不同地理区域的白纹伊蚊种群在7个微卫星位点呈现较丰富的遗传多样性和中低水平的遗传分化，种群间遗传差异随着地理距离的增加而增大。     

浙江省与日本A3型流行性感冒病毒株的血凝特性及HA1序列比较

目的：比较近年来在浙江省与日本流行的A3（H3N2）型流流行性感冒（流感）毒株的血凝特征与血凝素重链（HA1）区域的序列差异,方法：对浙江省不同性状的流感代表进行了抗原性分析,并与日本同期毒株作了血凝特性及HA1区域的氨基酸序列比较分析,结果：近年在浙江流行的A3型流行株,其抗原性已发生较大变异,其中绝大部分是对鸡红细胞缺乏凝集特性的O相毒株,它与A／武汉／359／95株二者在HA1区域的氨基酸同源性仅为94．82％,存在较大差异,这些O相毒株可以通过在MDCK细胞上的传代而转变为D相毒株,日本的同期毒株,其情况也相似,结论：A3型流感病毒在HA1区域发生的变异,是近年来引起浙江省流感流行的主要因素。     

Microsatellite loci in the carcinogenic liver fluke,Opisthorchis viverrini and their application as population genetic markers

Opisthorchis viverrini is a carcinogenic foodborne trematode endemic in Southeast Asia especially in Thailand and the Lao People's Democratic Republic. Opisthorchiasis causes hepatobiliary diseases and cholangiocarcinoma (bile duct cancer). Currently there is substantial evidence on genetic variation of O. viverrini but the information on population genetic structure is lacking. Because microsatellite DNA of this parasite is not available, we for the first time isolated and utilized microsatellite DNA as genetic markers to examine genetic diversity and the population structure of O. viverrini. Partial genomic DNA libraries were constructed by conventional and enrichment methods which yielded microsatellite-containing clones of 0.18–0.25% and 16.84%, respectively. Within 41 microsatellite loci isolated 36.59% were perfect, 60.98% were interrupted and 2.44% were compound microsatellites. The CA repetitions were the most frequent, followed by GT and CAT. Primers specific to the flanking regions of 12 microsatellite loci were developed to genotype 150 O. viverrini individuals from geographical localities in Thailand and Lao PDR. Allele numbers per locus ranged from 2 to 15, with the mean expected heterozygosity of 0.03–0.66. Analyses of O. viverrini from 5 localities revealed a high level of genetic diversity and had significant deviation from Hardy–Weinberg equilibrium. Significant heterozygote deficiency as well as heterozygote excess was detected across all localities indicating the possibility of selfing (inbreeding) as a predominant reproductive mode. Significant genetic differentiation (F_ST) was also detected between worms from different localities with varying levels of genetic heterogeneity. We discuss our results in terms of what these novel microsatellite markers reveal about the epidemiology and transmission dynamics of this medically important parasite, both in terms of the current study and their potential for future comprehensive population genetic studies O. viverrini sensu lato in Southeast Asia.