β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品研制

目的：研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品。方法：通过检索National Center for Biotechnology Information（NCBI）基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaTEM、blaPSE、blaCTX-M、blaCMY和blaOXA的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌。将工程菌传代培养15代,同时使用PCR扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性。大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品。使用PCR和RT-qPCR检测质粒标准样品的最低检出限。使用超微量分光光度计测定质粒标准样品的质量,RT-qPCR测定质粒作为模板扩增时的Ct值,以此评价标准样品的均匀性及贮藏稳定性。结果：5种重组质粒DNA可在工程菌中稳定遗传且无突变发生。成功制备5种质粒DNA标准样品,均匀性良好。各质粒DNA经梯度稀释后,PCR最低检出限在2.33×104-2.25×106 拷贝数/μL之间,RT-qPCR最低检出限在1.93-1850 拷贝数/μL之间。样品在37 ℃贮存14 d、4 ℃贮存3个月、-20 ℃贮存12个月稳定 性良好。结论：研究制备得到β-内酰胺类抗生素耐药机制编码基因blaTEM、blaPSE、blaCTX-M、blaCMY、blaOXA质粒DNA标准样品,目的基因遗传稳定性、标准样品的均匀性和贮存稳定性良好。     

小麦粉粉质曲线-稳定时间检测用标准样品的研制

根据GB/T 15000—2008《标准样品工作导则》的要求,建立小麦粉粉质曲线-稳定时间检测用标准样品的研制方法.以不添加任何添加剂的优质小麦粉为制备原料,通过混合机充分混合后分装.采用电子式粉质仪对样品的"稳定时间"进行均匀性、稳定性检验以及定值分析.结果表明:该标准样品均匀性良好、在0～10℃存储条件下24个月稳...     

晚籼米加工精度标准样品的研制

加工精度是大米产品的主要定等指标,也是大米贸易中定价的基础。加工精度不仅反映大米的外观品质,而且影响大米的食用品质。以符合GB1350-2009中等质量稻谷为原料,按照《标准样品工作导则》（GB/T 15000.1-15000.9）和《大米》（GB/T 1354-2018）的有关要求,选择《粮油检验 大米加工精度检验》（GB/T 5502-2018）中仪器检测法检验标准样品的留皮度。对大米加工精度样品开展均匀性、稳定性检验和定值及不确定度评估。研制出的晚籼米加工精度标准样品用于大米加工厂家的生产指导,也可用于第三方实验室人员考核、质量控制、仪器校准。     

木薯细菌性萎蔫病菌dnaA基因质粒标准样品的构建

目的构建木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因质粒标准样品。方法以木薯细菌性萎蔫病菌染色体复制起始因子dna A特异基因序列为靶标设计引物,通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,构建木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因片段的重组质粒。采用Pico Green DNA分子荧光定量方法对该质粒分子进行定值,对均匀性、稳定性及标准值进行研究,制备木薯细菌性萎蔫病菌dna A基因质粒标准样品。结果结果表明,木薯细菌性萎蔫病菌质粒标准样品定值为4.99μg/m L,可在-18~-20℃低温条件下长时间保存,在夏季高温期间一周内也可实现传输。结论该标准样品的研制解决了木薯细菌性萎蔫病菌的溯源参照物问题,为快速检测木薯细菌性萎蔫病菌奠定了基础。     

芝麻素标准样品的研制

依据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则》,研制芝麻素标准样品。以芝麻为原料,采用高速逆流色谱法分离制备芝麻素单体,通过UV、IR、MS和NMR等手段进行结构表征,同时进行薄层色谱鉴别和热重分析。芝麻素样品进行了均匀性检验、稳定性检验和8家实验室联合定值。结果表明:该样品均匀性良好,在0~4℃条件下储存36个月稳定性良好,定值结果确定其标准值为99.73%,置信度95%的不确定度为0.20。成功研制出了芝麻素国家标准样品,达到了GB/T 15000.3—2008规定的技术要求,样品具有溯源性,可用于芝麻素及相关产品的质量控制和检测方法评定。     

熊果酸标准样品的研制

依据GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》,研制熊果酸标样样品。以蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实为原料,采用大孔树脂富集,硅胶柱色谱分离结合重结晶的方法制备熊果酸单体,通过紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振等手段进行结构表征,同时进行薄层色谱鉴别和热重分析,建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测分析技术。熊果酸样品进行均匀性检验、稳定性检验和8家实验室联合定值。结果表明,该样品均匀性良好,在0℃～4℃储存条件下24个月稳定性良好,定值结果确定其标准值为99.80%,置信度95%的不确定度为0.18%。成功研制出了熊果酸国家标准样品,达到了GB/T 15000.3-2008规定的技术要求,样品具有溯源性,可用于熊果酸及相关产品的质量控制和检测方法评定。     

蔗果三糖标准样品的研制

根据GB/T15000-2008《标准样品工作导则》的要求,建立蔗果三糖标准样品的研制方法。采用P-2凝胶色谱法结合制备高效液相色谱法从低聚果糖产品中制备得到蔗果三糖,然后通过红外光谱、质谱、核磁共振谱(1HNMR、13CNMR、HMBC、NMQC、COSY)对样品的结构进行鉴定并对核磁信号进行归属。将样品分装成130瓶后,采用高效液相-蒸发光散射法进行均匀性和稳定性检验,通过对8家具有资质的实验室联合测定结果的数据分析,评定出定值结果和不确定度。结果表明:蔗果三糖标准样品的稳定性和均匀性良好,定值结果为99.87%,置信度为95%的不确定度是0.36%。研制出的蔗果三糖标准样品符合国家标准样品研制工作导则的技术要求,可用于有关蔗果三糖和低聚果糖产品的检测和质量控制。     

厚朴中和厚朴酚标准样品的研制

依据GB/T 15000.3-2008标准样品的工作导则,研制和厚朴酚标样样品。以厚朴药材的提取物为原料,采用高速逆流色谱法一步分离制备和厚朴酚单体化合物,通过紫外光谱、红外光谱、质谱、1H和13C核磁共振等技术手段进行化合物的结构表征,同时进行了薄层色谱、液质联用和热重分析纯度和水分含量,建立了和厚朴的高效液相色谱分析检测技术。和厚朴酚样品进行了均匀性检验、稳定性检验和8家实验室联合定值。结果表明,和厚朴酚样品具有良好的均匀性,在0~4℃储存条件下48个月含量稳定。将定值结果分析统计,确定其标准值为99.72%,置信度95%的不确定度为0.22%。成功研制出了和厚朴酚国家标准样品,达到了GB/T15000.3-2008规定的技术要求,样品具有溯源性,可用于和厚朴酚及相关产品的质量控制和检测方法评定。     

标准样品及其特性

给出了标准样品的定义，介绍了标准样品的溯源性概念、标准样品的标准化特性、均匀性及其检验、稳定性及其检验和标准样品的定值方法。     

沙门氏菌耐药谱及质粒耐药基因的筛查

目的:分析不同来源沙门氏菌耐药性及其质粒耐药基因携带情况,从而揭示质粒耐药基因与菌株耐药性的对应关系。方法:对226株食源性及医源性的沙门氏菌分离株用试卡法测试其耐药性,按2012年美国实验室标准委员会(CLSI)指导原则的标准计算细菌对抗菌药物的耐药率(R),中介率(I),和敏感率(S),并对具有耐药表型和中介表型的非敏感菌株进行质粒耐药基因的筛查。结果:针对青霉素类抗生素进行筛查,耐氨苄青霉素的菌株达到15.9%(36/226),耐舒巴坦/氨苄青霉素达到12.8%(29/226);针对氨基糖苷类抗生素,耐妥布霉素的菌株达到6.2%(14/226),耐庆大霉素5.8%(13/226);针对喹诺酮类抗生素,耐环丙沙星的菌株达到4.0%(9/226),耐左氧氟沙星1.8%(4/226);针对头孢菌素类抗生素,耐头孢唑啉4.4%(10/226),耐头孢他啶和头孢曲松分别为2.2%(5/226),耐头孢替坦0.9%(2/226)。针对碳青霉烯类和除青霉素类、头孢菌素类以外的β-内酰胺类的筛查结果均为敏感。β-内酰胺类抗生素非敏感菌株中,质粒上β-内酰胺类耐药基因携带率为59.5%(50/84),其中CMY基因携带率为10.7%(9/84),OXA基因携带率为27.3%(23/84),TEM基因携带率为39.2%(33/84),PSE基因携带率为1.2%(1/84)。喹诺酮类抗生素非敏感菌株中,质粒上喹诺酮类耐药基因携带率为14.7%(5/34),其中qnrA基因携带率为11.8%(4/34);qnrS基因携带率为2.9%(1/34)。对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素非敏感菌株中,质粒上acc(6’)-Ib-cr基因的携带率为17.1%(7/41)。仅CMY基因在食源性和医源性分离株中的分布具有统计学差异(χ2=5.480,P0.05)。结论:本研究涉及的沙门氏菌分离株中,对青霉素类抗生素耐药性较强,其次是氨基糖苷类、头孢菌素类和喹诺酮类。大多数耐β-内酰胺类抗生素的沙门氏菌菌株都携带相对应的质粒耐药基因,而耐喹诺酮类以及氨基糖苷类抗生素的沙门氏菌携带相对应的质粒耐药基因较少。     

单核细胞增生李斯特菌质粒DNA参考物质的研制

目的 研制一种能够用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌(以下简称单增李斯特菌)的质粒DNA标准物质.方法 设计一种质粒DNA包含目前常用于单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因,并对其稳定性、均匀性和量值可追溯性进行评价.评估其在实时定量聚合酶链式反应(PCR)检测中的适用性.结果 质粒DNA参考物质的最终定值...     

食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的制备方法,研制均匀稳定的标准物质。方法利用冷冻干燥法制备103 CFU/样品的标准物质,参照CNAS-GL 29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,抽取20件样品,利用平板计数法测定标准物质的均匀性,并对结果进行统计分析;将样品分别置于-20、25、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定,使用30种即食熟肉制品作为基质,并按照国标法检验标物物质的适用性。结果采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=0.922,符合标准物质的要求。标准物质在-20℃保藏28 d, 25、37℃保藏7 d,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均在103 CFU/样品的水平;标准物质加入到30种即食熟肉制品中,均可以检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论本研究所制备的单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的评价。     

诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的 制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程的质量控制。方法 1、对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCC Ph001)进行分子生物学的确认。2、将大肠杆菌噬菌体MS2培养物,采用冷冻干燥技术制成一定含量的微球。3、均匀性检验：取15件样品进行均匀性检验,采用三倍标准差原则对结果进行分析;4、长期稳定性检验：将样品放置于-20℃,于1个月、3个月、6个月、12个月取样,每个时间点取3个样进行检测进行分析。5、短期稳定性：样品放置于4℃和37℃环境,于1天、3天、5天、11天和1天、5天、7天、14天、28天,每个时间点取3个样进行检测。6、组织3家实验室进行协同标定。7、使用牡蛎、青蛤、甜瓜、胡萝卜、生菜等样品,作为贝类、硬质表面、蔬菜等样品代表对大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的使用效果进行确认。结果1、MS2大肠杆菌噬菌体分子生物学鉴定结果为大肠杆菌噬菌体MS2(Coliphage MS2)。2、采用冷冻干燥技术制备的大肠杆菌噬菌体MS标准物质微球,呈球形、白色、大小均一,符合制备的预期。3、采用三倍标准差原则,对样品均匀性检验结果分析,检测结果值都在平均值±三倍标准差范围内,均匀性符合要求;4、经-20℃,12个月长期稳定性监测,样品仍然稳定,-20℃可以作为长期储藏的条件;5、经4℃ 28天、37℃ 5天的短期稳定性监测,样品仍然稳定,,证明样品可以采用常温的方式进行运输,4℃条件可以作为短期样品储存的条件。 6、经3家实验室协同标定,样品检测结果为阳性,CP值与均匀性检验的平均值比较差异不大,可以作为过程质量控制使用。7、以牡蛎、青蛤、甜瓜、胡萝卜、生菜等样品作为基质进行实用性验证,表明可以作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质使用。结论 大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2(Coliphage MS2)的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。     

粗脂肪标准物质的制备及均匀性和稳定性研究

用全麦粉作为粗脂肪标准物质的基体,对粗脂肪标准物质的制备程序和工艺以及标准物质的均匀性和稳定性进行了研究。采用粉碎、混匀、干燥、分装、Co-60辐照灭活(辐照量为2.5Mrad)全麦粉粗脂肪标准物质的制备工艺。粗脂肪标准物质样品的均匀性检验结果经F检验以及14个月稳定性监测结果经t检验表明,单元内和单元间均匀程度以及标准物质样品的稳定性均达到国家一级标准物质的制备要求。     

河鲀鱼基质中河豚毒素标准样品的研制

目的 研制基于河鲀鱼基质的河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)定量分析标准样品。方法 以野生河鲀鱼肝脏、卵巢、精巢和肌肉组织为基料,利用正己烷脱脂分离处理后,经两次冷冻干燥制备河鲀鱼基质的TTX标准样品,采用液相色谱-串联质谱法进行定性确证。样品分装成500瓶后,进行均匀性、稳定性检验和定值分析。结果 经确证该基体标准样品中含有TTX;从基体标准样品中随机抽取15瓶进行均匀性检验,经F检验表明在95%的置信区间范围内样品均匀性良好;长期稳定性考察在0～4℃低温条件下历经了长时间保存,短期稳定性在-80～55℃范围内进行运输条件下的考察,结果表明在考察期间内样品稳定性良好;经国内8家实验室进行协同定值,评定了定值结果的不确定度,该基体标准样品中TTX特性值及不确定度为(5.20±0.03)mg/kg(k=2)。结论 该基体标准样品达到国家标准样品的技术要求,可用于对水产品中河豚毒素检测过程的方法验证与质量控制等活动。     

食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的制备方法, 研制均匀稳定的标准物质,用于实验室内部质量控制。方法采用冷冻干燥技术制备含量为4-5×104CFU/样品的菌球,参照《CNAS-GL29：2010标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,随机抽取20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20℃、4℃、25℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。并组织3家实验室进行协同标定,再使用20件食品作为基质,按照国标法检验大肠埃希氏菌标准物质的适用性。结果对20瓶标准物质的均匀性检测结果进行单因子方差分析： F=1.933, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d,复苏率为96.2%;在4 ℃保藏14 d,复苏率为77.0%;25 ℃保藏7 d,样品中菌含量仍保持在104CFU/样品的水平,说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在104CFU/样品水平,生化鉴定结果均符合大肠埃希氏菌的特征;标准物质加入到20种食品基质中, 均可以检出大肠埃希氏菌,活菌含量仍保持在104CFU/样品的水平。结论本研究所制备的大肠埃希氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中大肠埃希氏菌检测结果的评价。     

黄瓜中毒死蜱残留基体标准物质的研制

目的 建立黄瓜中毒死蜱残留基体标准物质的研制方法。方法 选择符合标准物质研制要求的新鲜黄瓜为研制对象,经过预冻干、添加、混匀、二次冻干、过筛、包装及辐照灭菌,采用气相色谱-串联质谱法测定,同位素内标法定量,经均匀性和稳定性检验后,采用多家实验室合作定值的方式进行定值。结果 通过11家独立实验室合作定值及不确定度评估,毒死蜱的特性值为0.403±0.033 mg/kg(k=2)。结论 研究表明获得的样品均匀性和稳定性良好,适用于黄瓜中毒死蜱检测过程的方法研制和质量控制。     

乳粉中三聚氰胺标准物质的制备

目的制备乳粉中的三聚氰胺标准物质。方法将三聚氰胺标准溶液与乳粉复溶液通过均质、冷冻干燥、粉碎、过筛、混合等步骤制得标准物质,经均匀性与稳定性研究,由8家实验室进行协同定值,并进行不确定度评估。结果制得的标准物质的特性值为(5.19±0.37) mg/kg,均匀性良好,稳定性大于12个月。结论通过该方法制得的标准物质,均匀性与稳定性良好。可用于检测方法的开发、检测过程的质量控制、实验室能力验证、实验室间比对等领域。