多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。     

酱油中抗草甘膦大豆转基因多种成分的检测:实时荧光定量PCR和传统PCR的比较

采用基于SYBR Green探针的实时荧光定量PCR方法和传统PCR方法对酱油中的大豆转基因靶基因Ca Mv35S启动子、NOS终止子、EPSPS、18S进行了高通量检测,同时检测了内源参照Lectin基因。研究发现,酱油样品中同时存在Ca Mv35S、NOS、18S靶基因,而不存在靶基因EPSPS,表明转基因成分EPSPS在食品加工过程中已被降解;熔解曲线分析表明,实时荧光PCR对转基因的检测获得了很好的特异性,与传统PCR相比,具有快速、高通量、高选择性、高灵敏度的优势。本研究建立的对酱油中多种抗草甘膦大豆转基因成分的快速、高通量、高灵敏的定量检测方法将在转基因食品的检测领域具有很大的应用前景。     

转基因抗虫大豆MON87701品系实时荧光PCR检测方法的建立

建立Taq Man实时荧光PCR反应检测转基因抗虫大豆MON87701品系的鉴定方法,为转基因大豆MON87701提供科学的检测依据。根据转基因抗虫大豆MON87701品系特异基因序列设计引物和Taqman探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果表明,本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏度可达到0.01%(m/m),检测重复性好。因此,建立的转基因大豆MON87701品系特异Taq Man实时荧光PCR检测方法可快速、准确地鉴定转基因抗虫大豆MON87701品系,可在日常检验中推广应用。     

利用实时荧光P CR技术快速检测玉米籽粒中转基因成分

[目的]利用Taq Man特异性荧光标记法快速检测玉米籽粒中转基因成分。[方法]外源基因选取具有一定代表性的Ca MV35S启动子、NOS终止子、BAR、Cry IA(b)基因,数据结果由实时荧光定量PCR反应的Ct值判定。[结果]用该方法检测玉米籽粒中未含有转基因成分,可作为结果判定。[结论]该方法在样品量大时极具优势,高效,准确,对环境污染较小。     

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。     

玉米转基因成分的检测

基于实时荧光PCR技术,通过构建阳性质控,对一种玉米样品进行多种转基因成分分析。首先,筛选出玉米样品中常见的外源转基因片段,构建阳性质粒并对阳性质粒进行验证;然后,对样品中可能含有的调控元件、目的基因以及筛选基因进行检测分析。实时荧光PCR检测结果表明,转基因玉米样品中含有2种启动子(pCaMV35S和pRice-Actin)、2种终止子(tNOS和tCaMV35S)、3种目的基因[Cry1A(c)、CP4-EPSPS和CTP2-CP4-EPSPS]以及1种筛选基因(PMI)。因此所检测的玉米样品中含有多种转基因成分,推测其转基因玉米样品含有多种转基因玉米品系。     

玉米中转基因成分筛查策略

根据商业化转基因玉米外源基因元件信息,构建玉米转基因检测分子特征矩阵,并根据元件信息建立转基因玉米的筛查检测策略。结果表明:利用CaMV35S启动子、NOS终止子2个元件的组合,可完成对现有转基因玉米转化事件的筛查检测,检测灵敏度可达到1g/kg。该筛查方法可对玉米中的转基因成分进行快速、高灵敏度的筛查。     

含有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针实时荧光PCR检测方法的建立

【目的】建立含有扩增内标（IAC,Internal amplification control）的用于食品中猪肉和鸡肉成分鉴别的Taqman探针实时荧光PCR检测方法。【方法】分别基于猪的beta actin 基因和鸡的transforming growth factor 基因设计引物和探针;考察引物和探针的特异性与灵敏度;设计并构建扩增内标,优化体系中扩增内标浓度,建立内标实时荧光PCR体系;使用该检测体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板进行检测评价;应用该体系对市售38份样本进行盲样检测。【结果】含有扩增内标的Taqman探针实时荧光PCR体系能有效地进行食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测,非目标物种在40个循环内均无出现扩增,检出限均为0.5 ng DNA;该体系对鲜肉和熟肉来源的DNA模板检测无显著差异;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】该方法准确稳定,可用于食品中猪肉和鸡肉成分的快速检测。     

油菜中转基因成分的筛查检测策略

旨在建立油菜中转基因成分的快速筛查方法,服务于农业转基因生物安全监管。根据转基因油菜常用转化遗传元件信息建立转基因油菜的筛查策略,并使用定性PCR法检测。结果表明,利用CaMV35S启动子、NOS终止子、bar基因、pat基因、CP4-epsps基因和NPT II基因6个靶标元件的组合,理论上可筛查92%的已知商业化转基因油菜转化事件。该方法的检测灵敏度达到1g/kg,可对油菜中的大多数转化事件进行快速、高灵敏度的筛查。     

转基因玉米种子的PCR检测

以PCR技术为基础,建立了检测玉米种子中转基因成分的方法。对提取的基因组DNA进行PCR以扩增玉米内源基因zSSIIb,设计了常见的CaMV 35 S启动子、NOS终止子、Bar终止子、Bt,进行了初步的定性筛选,并用Bt176对阳性结果进行验证,结果表明:这是一套转基因玉米定性PCR检测方法,具有较高的准确性、可靠性,可以用于转基因玉米种子及其产品的筛查、抽检。     

利用复合PCR结合DNA芯片的方法进行快速转基因事件检测

以我国批准进口用作加工原料的6种转基因玉米为材料,根据其外源基因、载体构建及插入位点,应用6对特异性引物及35S、NOS引物,设计并优化了复合PCR反应体系,对其进行转基因成分检测.同时尝试利用复合PCR与DNA芯片相结合,对不同转基因玉米混合样品进行检测,探索建立转基因事件快速检测和确认方法.     

转基因油菜筛查阳性质粒分子的研制及应用

【目的】 转基因油菜是四大转基因作物之一,是中国转基因生物安全监管的重要对象,转基因检测为转基因安全监管提供技术支撑。转基因筛查是转基因检测的第一步,筛查靶标设置不合理会导致漏检部分转基因成分。建立转基因油菜筛查策略,并研制与筛查策略配套的阳性质粒分子,将为中国的转基因油菜安全监管提供强有力的技术支撑。【方法】 通过收集数据库中登记的转基因油菜品种的外源基因元件信息,分析转基因油菜品种中常用的调控元件和标记基因,基于最大筛查覆盖率原则,确定转基因油菜的筛查靶标。通过检索数据库或查询专利,收集筛查元件的核苷酸序列。一个筛查元件通常有多个标准方法,查阅各筛查元件的检测标准,分析各标准中普通PCR引物对和实时荧光PCR引物/探针组合在筛查元件核苷酸序列中的位置,根据引物探针的结合位点,确定拟构建到质粒上的各筛查元件的核苷酸序列。人工合成各筛查元件和油菜内标基因的融合序列,克隆到常用质粒pUC18,构建阳性质粒分子。采用各筛查元件的普通PCR和实时荧光PCR方法,评估阳性质粒分子的适用性。【结果】 建立了转基因油菜的筛查策略,通过检测CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、Bar、PAT、CP4-EPSPS、NPTⅡ、HPT、NOS终止子和PinⅡ终止子共9个基因元件,可实现已知信息转基因油菜品种的全覆盖。构建出聚合9个筛查元件和2个油菜内标基因HMG I/Y和CruA的转基因油菜筛查质粒分子pYCSC-1905。9个筛查元件和2个油菜内标基因的扩增效率均在90%—110%,证明质粒分子上的不同靶标序列没有相互干扰,影响PCR的扩增效率。质粒分子pYCSC-1905可用作9个筛查元件和2个油菜内标基因的通用阳性对照,适用于国家标准（GB/T和农业农村部公告）、出入境检验检疫行业标准（SN/T）和欧盟标准。【结论】 提出的转基因油菜筛查策略涵盖9个基因元件,可实现从商业化到安全评价各阶段转基因油菜的筛查检测,显著降低转基因油菜的筛查漏检率。研制的配套质粒分子pYCSC-1905为转基因油菜筛查和各基因元件标准方法的应用提供了通用标准样品,保证检测机构间检测数据的准确性和可比性。     

四种转基因玉米新型质粒标准分子协同实验验证

构建了分别适于转基因玉米GA21、TC1507、T25和Bt11品系特异性双重PCR检测标准分子,并对其在定性PCR检测体系中的适用性进行了实验室间协同实验验证。对7家实验室返回结果的统计分析表明,标准分子pBt11、pTC、pT25和pGA分别对转基因玉米Bt11、TC1507、T25和GA21品系具有高特异性。4个标准分子在zSSⅡb和对应品系特异性序列单一PCR检测体系中检测下限均为50拷贝。因此,4个标准分子均可作为新型标准物质用于相应转基因玉米品系特异性定性检测。     

SYBR? Green qPCR Screening Methods for Detection of Anti-herbicide Genes in Genetically Modiifed Processed Products

The use of genetically modified organisms (GMOs) as food products becomes more and more widespread. The European Union has implemented a set of very strict procedures for the approval to grow, import and/or utilize GMOs as food or food ingredients. Thus, analytical methods for detection of GMOs are necessary in order to verify compliance with labelling requirements. There are few effective screening methods for processed GM (genetically modified) products. Three anti-herbicide genes (CP4-EPSPS,BAR andPAT) are common exogenous genes used in commercialized transgenic soybean, maize and rice. In the present study, a new SYBR? Green qPCR screening method was developed to simultaneously detect the three exogenous anti-herbicide genes and one endogenous gene in a run. We tested seven samples of representative processed products (soya lecithin, soya protein powder, chocolate beverage, infant rice cereal, maize protein powder, maize starch, and maize jam) using the developed method, and amplicons of endogenous gene and transgenic fragments were obtained from all the processed products, and the sensitivity was 0.1%. These results indicated that SYBR? Green qPCR screening method was appropriate for qualitative detection of transgenic soybean, maize and rice in processed products.     

运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系的研究

[目的]运用微滴式数字PCR技术检测转基因玉米品系。[方法]基于微滴式数字PCR平台,建立3种转基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法。[结果]特异性试验结果显示,该法只有特定品系的靶序列才有扩增信号。灵敏度试验表明,该方法在10 pg基因组DNA用量时可定量检测到2~16个拷贝。[结论]该研究建立的3种转基因玉米品系定量检测方法特异性强、灵敏度高,可用于进出口农产品中3种转基因玉米品系成分的定量检测。     

喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

为寻求喀斯特炭疽菌的快速检测方法,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以喀斯特炭疽菌基因组中的ACT基因为靶序列设计并筛选特异性引物探针,通过特异性、灵敏度、重复性试验建立喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立方法的特异性较强、灵敏度较高、重复性稳定性较好,最低检测限为0.2pg DNA/反应,标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.998。该方法操作简便,可用于进出境口岸喀斯特炭疽菌的检疫。     

多重PCR分析方法应用于转基因农作物的检测

以转基因大豆、水稻等样品为材料,采用多重PCR技术对转基因作物中常见的启动子、终止子、筛选标记基因和转入的目的基因等多个外源转基因元件进行检测,以期建立一套快速、准确、高效的转基因农作物筛查鉴定技术。通过多重扩增实验,建立了关于转基因大豆检测的大豆内源Lectin基因,花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS终止子的三重PCR分析体系,及关于转基因水稻检测的CaMV35S、NPTII和HPT基因的三重PCR分析的技术体系。并以大豆、水稻等农作物样品为检测材料,采用单一PCR和多重PCR技术同时进行检测,结果表明多重PCR方法具有快速、高效、简便、准确等特点,在转基因成分的检测上具有非常重要的实际应用价值和潜力。     

实时荧光PCR 法特异性检测棉花曲叶病毒

根据棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl virus,CLCuV)运动蛋白基因序列特征,设计并合成了特异性Taqman探针和检测引物,建立该病毒的实时荧光PCR快速检测方法。结果表明:该方法可以特异性地从5个不同CLCuV分离物中扩增到荧光信号,而其他6种病毒均无扩增。建立的方法具有快速、准确、灵敏及简便等特点,可为进出境植物检疫和农业安全生产提供可靠的技术支持。