喉癌中p16基因突变和甲基化的研究

目的 探讨ｐ１６基因在喉癌发生发展中的作用和在喉癌中的失活机制。方法 应用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙ－ｓｉｓ,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）银染方法和ＰＣＲ甲基化敏感内匹酶方法检测３２例喉癌和相应癌旁组织的ｐ１６基因第１,第２外显子突变和甲基化热点区域部分内切酶     

p16基因突变与喉癌生物学行为的相关性

目的 :研究 p16基因突变与喉癌生物学行为及预后的关系。方法 :应用 PCR- SSCP对 2 4例喉癌组织及 10例喉部良性病变组织中 p16基因 (exon2 )进行检测。结果 :喉癌突变检出率为 6 2 .5 % (15 / 2 4) ,而且随着组织分化程度、浸润范围和淋巴结转移的不同而不同 ;喉部良性病变无一例突变。结论 :p16基因突变与喉癌的多种生物学行为有明显关系 (P≤ 0 .0 5 ) ;这种关系有助于判断喉癌的恶性程度及预后。 PCR- SSCP检测喉癌突变 ,具有敏感、简便、重复性好 ,快速而经济等优点 ,是一种适用于临床样本筛选的方法。     

p16基因和蛋白与喉癌关系的研究进展

喉鳞状细胞癌是常见的头颈部恶性肿瘤，与其他恶性肿瘤一样，喉癌的发生也是一个多因素参与的、多阶段的复杂过程，其中抑癌基因的缺失和功能丧失在肿瘤发生、发展中起着十分重要的作用。p16基因是新近发现的一个重要的抑癌基因，其抑癌作用和在恶性肿瘤中的高频率突变，提示其参与了肿瘤的发生过程。本文对p16基因、蛋白与喉癌关系的研究进展进行综述。     

p16与Rb基因在喉癌中的表达及其临床意义

目的:探讨抑癌基因p16和Rb在喉肿瘤中的表达及其相互关系 .方法:用免疫组织化学方法观察40例喉鳞状细胞癌p16和Rb基因的表达. 结果:喉癌标本中p16和Rb阳性表达率分别为42.5%和57.5%,其中7例肿瘤组织(17.5%)p16和Rb基因均阳性表达,未见同一肿瘤组织中两者均缺失.在喉癌的临床类型、分期及组织分化程度方面p16和Rb基因的阳性表达率差异有显著性(P＜0.05). 结论:p16和Rb在喉肿瘤的发生发展过程中起重要作用;但两者同时表达缺失较少见.     

多肿瘤抑制基因—p16在喉癌中的丢失研究

目的：探讨ｐ１６基因的缺失与人喉癌的发生、发展的关系。方法：应用ＲＴ－ＰＣＲ及免疫组化方法检测ｐ１６。结果：４４例喉癌患者中２３例存在ｐ１６的失活,失活率为５２．３％,ｐ１６基因的失表达与喉癌的组织学分化程度及临床分期有密切关系（Ｐ＜０．０５）,表明ｐ１６基因的变异有可能与人喉癌的发生发展有关,提示检测ｐ１６基因的丢失对于判断喉癌的恶性度及估计病情的进展具有重要意义。结论：随着对ｐ１６基因的不断了解,将为肿瘤的临床诊断、基因治疗提供新的思路和线索。     

p16基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

OBJECTIVE: To assess the anti-tumor effects of p16INK4A gene transfer in laryngeal squamous cell carcinoma. METHODS: A Complete p16INK4A gene was inserted into a replication-defective recombinant adenovirus (Ad-p16) and the tumor cells were infected with Ad-p16. Confirmation of p16INK4A protein expression after Ad-p16 infection was performed by Western Blotting. The therapeutic effects were evaluated both in in vitro and in vivo study. RESULTS: The replication-defective recombinant adenovirus can direct a high level of p16INK4A protein expression in laryngeal squamous cell carcinoma. Studies both in in vitro and in vivo experiments demonstrated that Ad-p16 treatment significantly inhibits the cell growth and the established tumors in nude mice. The mean value of tumor volumes among the Ad-p16, Ad-Lacz and phosphatic buffered saline(PBS) groups was (91.00 +/- 6.32) mm3, (137.00 +/- 9.62) mm3 and (144.00 +/- 13.87) mm3 respectively. Statistic analysis showed that there was a significant difference between the Ad-p16 group and the control groups (P < 0.05). No significant difference was found between Ad-lacZ and PBS groups, which indicated that the antitumor effects was not influenced by the adenovirus. CONCLUSION: These results demonstrate a significant antitumor effect of Ad-p16 against human laryngeal squamous cell carcinoma. This data also further support the potential application of Ad-p16 to treat the human head and neck cancer.     

p16蛋白在喉癌前期病变中的表达及意义

目的：通过喉粘膜上皮中p16表达的实验,讨论p19蛋白在喉癌发生过程中的作用。方法：用S－P法检测106例喉癌前期病变标本中p16蛋白的表达,并设30例喉正常上皮和32例喉鳞癌作对照。结果：p16蛋白在喉正常粘膜上皮中阳性率为86．67％;喉癌前期病变中为75．47％,喉鳞癌中为37．5％,两者差异有显著性（P＜0．05）,喉癌前期病变随病变程度加重p16阳性率呈下降趋势,单纯增生组（83．33％）与重度不典型增生组（55．56％）差异有非常显著性（P＜0．01）。结论：p16基因表达的缺失与喉癌的发生有关;p16蛋白的表达可作为判断喉癌前期病变向恶性肿瘤化危险性的一个参考指标。     

喉癌细胞系中RASSF1A基因启动子去甲基化与基因表达的研究

目的:探讨甲基化转移酶抑制剂[5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)]及组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂[曲古抑菌素A (TSA)]对喉癌细胞系中抑癌基因RASSF1A甲基化水平及基因表达的影响.方法:5-Aza-dC及TSA处理体外培养的Hep-2细胞,应用Realtime PCR方法及甲基化特异性PCR(MSP)方法分别检测药物干预前后细胞中抑癌基因RASSF1A表达及甲基化情况.结果:①在Hep-2细胞中未经药物干预前抑癌基因RASSF1A表现为甲基化,抑癌基因RASSF1A弱表达.②在5-Aza-dC及TSA的作用下,Hep-2细胞系中RASSF1A基因的甲基化状态得到了逆转.其中5-Aza-dC及TSA联合应用效果与单独应用5-Aza-dC效果相似,单独应用TSA无明显效果.③在5-Aza-dC及TSA的作用下,Hep-2细胞系中RASSF1A基因表达上调,其中5-Aza-dC作用较TSA作用强,2种药物联合应用起协同增效作用.结论:喉癌细胞系中抑癌基因RASSF1A启动子甲基化可能是导致其基因失活的主要原因但并不是惟一原因.应用5-Aza-dC及TSA能够通过逆转抑癌基因RASSF1A的DNA甲基化水平和组蛋白去乙酰化水平从而使其表达得到了增强.     

喉癌细胞系中抑癌基因MGMT表达与DNA甲基化及组蛋白H3-K9甲基化的关系

目的:探讨喉癌Hep-2细胞中组蛋白H3-K9甲基化与DNA甲基化及抑癌基因MGMT表达的关系。方法:应用去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理体外培养的Hep-2细胞。应用染色质免疫沉淀技术、甲基化特异性聚合酶链反应和实时定量逆转录聚合酶链反应分析药物作用前后MGMT基因启动子区组蛋白H3-K9甲基化、DNA甲基化和MGMT表达情况。结果:①在Hep-2细胞未经药物干预前,MGMT表现为DNA甲基化,组蛋白H3-K9高甲基化,MGMT低表达。②在5-Aza-dC的作用下,Hep-2细胞中MGMT的组蛋白H3-K9甲基化状态被降低;MGMT的DNA甲基化状态得到了逆转;原来低表达的MGMT表达上调。结论:喉癌细胞系中MGMT启动子区甲基化可能是导致其基因失活的主要原因。DNA甲基化可能导致组蛋白H3-K9高甲基化。应用5-Aza-dC能够通过逆转MGMT的DNA甲基化水平从而降低MGMT组蛋白H3-K9甲基化水平来使抑癌基因表达上调,从而抑制肿瘤的发生和发展。     

重组腺病毒介导的p16基因在喉癌细胞系Hep-2的表达

目的 研究外源性P16基因对喉癌细胞系Hep-2的作用，并探讨P16基因用于治疗喉癌的可行性，方法 将重组体泉病毒介导的P16基因转染到人喉癌细胞系Hep-2，用免疫组化、打点杂交方法检测P16基因在细胞转染前后的表达情况，应用流式细胞仪，细胞DNALadder等方法研究P16基因对喉细胞周期、形态、生长等特性的影响。结果 感染P16基因的Hep-2细胞内有源外源性P16基因的表达，细胞周期明显变化，细胞从G1期到S期发生抑制，细胞有退行性改变，重组体腺病毒能介导外源基因P16在喉癌Hep-2细胞系中高效表达。重组体腺病毒介导的P16在Hep-2细胞系中表达，能抑制Hep-2细胞系的生长，流式细胞仪计数和细胞DNALadder证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生调亡并导致G1期阻滞。结论 P16基因抑制喉癌细胞系Hep-2的生长可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡及G1期阻滞而发挥作用。     

喉鳞状细胞癌P16和增殖细胞核抗原表达

目的探讨p16基因及增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学技术SP法检测抑癌基因p16蛋白及PCNA在40例喉鳞状细胞癌中的表达,并与癌旁组织和正常喉组织对比,结合喉鳞状细胞癌的临床病理特征进行分析。结果在喉鳞状细胞癌中p16阳性率(50.0%)明显低于癌旁组织(76.0%)和正常组织(100.0%,P<0.05);Ⅰ、Ⅱ期喉癌中p16阳性率明显高于Ⅲ、Ⅳ期。喉鳞状细胞癌中PCNA阳性率为55.0%,明显高于癌旁组织(32.0%)和正常组织(10.0%,P<0.05);Ⅰ、Ⅱ期喉鳞状细胞癌中PCNA表达明显低于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)。p16阳性与阴性患者生存期≥5年的比率分别为66.7%和33.3%,P<0.05;PCNA阳性与阴性患者生存期≥5年的比率分别为37.5%和62.5%,P<0.05。结论p16和PCNA分别是喉鳞状细胞癌进展及预后判断的独立指标;p16和PCNA联合检测对喉鳞状细胞癌的预后评估可能更有价值。     

p16与C—myc在喉鳞状细胞癌中的表达意义

目的：研究p16和C－myc在喉鳞状细胞癌中的表达意义。方法：应从p16和C－myc单克隆抗体，通过免疫组织化学法检测6例正常喉粘膜和47例喉鳞癌中p16和C－myc的表达。结果：6例正常喉粘膜组织中未发现p16和C－myc蛋白阳性表达，47例喉鳞癌中p16和C－myc阳性表达率分别为48．9％（23／47）和57.4％（27／47），与性别、年龄和肿瘤发生的部位无相关性（P＞0．05），与临床分期和病理分级相关（P＜0．05）；C－myc还与颈淋巴结转移相关（P＜0．05）。结论：p16和C-myc蛋白阳性表达在喉鳞癌的发生和发展中起重要作用，可作为评价喉鳞癌预后的新指标。     

p16蛋白表达与喉癌临床病理关系的研究

目的探讨p16蛋白表达与喉鳞状细胞癌的临床病理关系. 方法应用免疫组化SP法检测60例喉鳞癌组织中p16的蛋白表达情况. 结果 p16蛋白在喉鳞癌组织中的阳性表达率明显低于正常喉黏膜组织(P<0.05).随着临床分期的进展及组织学分化程度的降低,p16蛋白表达进一步降低.有颈淋巴结转移的喉癌组织p16蛋白阳性表达低于无转移的喉癌组织. 结论检测p16蛋白表达状况对喉癌的早期诊断和预后评估有临床参考价值.     

喉鳞状细胞癌组织中p63表达的临床意义

目的：探讨p63基因在喉鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法：用免疫组织化学法检测63例喉鳞状细胞癌（喉癌组）及其45例癌旁组织（癌旁组）、24例转移淋巴结（转移淋巴结组）、40例未转移淋巴结（未转移淋巴结组）及25例喉非癌组织（非喉癌组）中p63基因的表达。结果：p63基因在喉鳞状细胞癌组织中均为细胞核阳性表达,喉癌组及转移淋巴结组的中、强阳性率为95．2％（60／63）和83．3％（20／24）;癌旁组及未转移淋巴结组中无中、强阳性表达;非喉癌组中1例乳头状瘤为弱阳性表达,其余均为上皮细胞或基底细胞核弱阳性表达。结论：p63可作为喉鳞状细胞癌有特异性的标记物,对喉鳞状细胞癌的早期诊断和鉴别诊断有重要意义。p63可能主动参与了调控喉鳞状细胞癌的发生过程,但在喉鳞状细胞癌的发展过程中处于被激活状态,可能在发展过程中发挥负反馈的作用。     

RASSF2A基因甲基化在喉癌组织中的表达及意义

目的 探讨抑癌基因RASSF2A表达水平及其基因异常甲基化与喉癌的关系及意义。 方法 采用RT-PCR及甲基化特异性PCR(MSP)检测50例喉癌组织(实验组)和10例癌旁正常黏膜组织(对照组)中RASSF2A基因mRNA的表达水平及其启动子甲基化状态。 结果 喉癌组织中有54%(27/50)存在RASSF2A基因启动子,而对照组正常黏膜组织中未发现RASSF2A基因甲基化现象,差异有统计学意义(χ2=9.818, P=0.002)。RASSF2A甲基化水平程度与喉癌患者临床病理特征无明显相关性。喉癌组织中RASSF2A基因mRNA的表达水平明显低于正常黏膜组织(χ2=9.818, P=0.002)。RASSF2A基因甲基化的喉癌组织中其mRNA的表达减少,反之亦然。 结论 喉癌组织中RASSF2A基因CpG岛甲基化与其基因表达缺失有关,可能参与了喉癌的发生发展过程。     

喉及下咽鳞状细胞癌的ras基因突变热点的研究

目的 :研究 ras基因 ( N-ras,K-ras,H-ras)第 1 2密码子在喉及下咽癌组织中的突变情况。方法 :采取多聚酶链延伸反应 -限制性片段长度多态性分析 ( polymerase chain reaction-restricted fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)方法 ,对 3 7例喉癌、下咽癌手术标本进行三种 ras基因测定。结果 :三种 ras基因的 1 2位密码子在喉癌及下咽癌组织中的突变率为 3 5.1 % ,其中 N-ras基因的 1 2密码子突变率为 1 6.2 % ( 6/3 7) ,K-ras变突率为 1 3 .5% ( 5/3 7) ,H-ras基因的突变率为 5.4 % ( 2 /3 7)。其突变率与喉癌、下咽癌组织分化类型和分化程度无明显相关性。结论 :ras基因第 1 2密码子是喉癌、下咽癌的突变热点。     

喉癌组织中Survivin和p63的表达及临床意义

目的：探讨Survivin、p63在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中的表达及与LSCC发生、发展的关系和生物学意义。方法：应用原位分子杂交方法,检测Survivin mRNA、p63 mRNA在47例LSCC组织、癌旁组织及14例正常喉组织中的表达。结果：①Survivin mRNA在正常喉组织中不表达;在LSCC组织、癌旁组织中的阳性表达率分别为59．6％（28／47）、25．5％（12／47）,其差异有统计学意义（P〈0．05）;组织分化程度越低、TNM分期越晚、淋巴结转移率越高,则Survivin mRNA表达越强（均P〈0．05）。②p63mRNA在LSCC组织、癌旁组织中的阳性表达率分别为91.5％（43／47）、93．6％（44／47）,分别与正常喉组织（57．1％）比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;p63 mRNA与喉癌临床病理特征无关。结论：Survivin在LSCC中表达上调,提示其通过抑制细胞凋亡在LSCC的发生、发展过程中起重要作用,可能成为LSCC基因治疗的新靶点;其高表达预示肿瘤有较高的侵袭性和不良预后。p63对LSCC生物学行为的影响较小。     

喉鳞状细胞癌组织中Survivin基因与p15和p16基因表达的关系

目的　探讨抑凋亡基因Survivin(SVV)在喉鳞状细胞癌 (laryngealsquamouscellcarcinomas,LSCC)中的表达意义及与抑癌基因p15、p16表达的关系。 方法　采用免疫组化链酶卵白素 生物素复合体 (strepavidin biotincomplex ,SABC)方法检测了 4 8例LSCC组织及 2 4例癌旁组织、2 4例正常喉黏膜组织SVV、p15、p16蛋白的表达并进行统计分析。 结果　SVV蛋白在正常喉黏膜中不表达 ,4 8例LSCC组织中 2 7例SVV蛋白阳性表达 ,占 5 6 3% ,2 4例癌旁组织中 6例SVV蛋白阳性表达 ,占 2 5 0 % SVV蛋白在LSCC组织与癌旁组织中的表达以及SVV在癌旁组织与正常喉黏膜中的表达差异均有显著性 (P <0 0 5 )。SVV蛋白表达与LSCC的发生部位、TNM分期、病理分级、淋巴结转移及预后有关 (P <0 0 5 )。p16蛋白强阳性组、p16蛋白弱阳性组及 p16蛋白阴性组的SVV蛋白阳性率差异有显著性 (P <0 0 0 1) ,且表达呈正相关 (C =0 5 2 )。p15蛋白阳性组与 p15蛋白阴性组的SVV蛋白阳性表达差异无显著性。结论SVV基因在LSCC的发生发展中起重要作用 ,并对LSCC的早期诊断、预后判断有意义。SVV的过度表达与 p16抑癌作用的失去可能在LSCC的发病机制中有协同作用。