反义寡核苷酸抑制TGFβ1诱导人肾小管上皮细胞表达CTGF

目的研究结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,AS)转染人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)后对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导CTGF表达的抑制作用.方法采用脂质体转染试剂DOTAP,包裹针对CTGF的反义寡核苷酸转染HKC.用MTT比色法检测DOTAP对细胞增殖的影响,用荧光显微镜和荧光分光光度计检测5′异硫氰酸荧光素(5′FITC)标记的AS在细胞内的分布,用RT-PCR和免疫组化分别检测TGFβ1和AS对CTGFmRNA和蛋白表达的影响.结果MTT比色:不同浓度(0、3.3、6.7、10μl/ml)的DOTAP对细胞增殖的影响无明显差异(P＞0.05).荧光检测:DOTAP能高效地介导AS转染入HKC.RT-PCR和免疫组化:浓度为40μg/ml的TGFβ1能诱导HKC表达CTGFmRNA和蛋白,同时加入DOTAP-AS复合物后(DOTAP浓度为6.7μl/ml,AS浓度为1μg/ml),CTGFmRNA和蛋白的表达明显下降(P＜0.01).结论DOTAP能高效低毒地把CTGF反义寡核苷酸转染入HKC,进而能有效地封闭TGFβ1所诱导的CTGF表达.     

脂质体介导Bcl-2反义脱氧寡核苷酸对人卵巢癌细胞作用的研究

目的 探讨bcl-2反义脱氧寡核苷酸体外转染卵巢癌细胞后,对癌细胞bcl-2基因表达调控作用、诱导其凋亡的作用以及对顺铂敏感性的影响.方法 体外培养顺铂耐药的人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3,以阳离子脂质体为载体,将bcl-2反义脱氧寡核苷酸片断作用于CAOV3细胞.应用逆转录聚合酶链反应(BT-PCR)技术检测bcl-2基因的表达;流式细胞仪(FACS)检测转染后CAOV3细胞调亡的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测转染后CAOV3细胞对顺铂敏感性的影响.结果 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞后,bcl-2基因mRNA 表达水平显著低于对照组(P<0.01),并可诱导卵巢癌细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.结论 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞,可下调bcl-2基因的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡,并增强CAOV3细胞对顺铂的敏感性.     

反义PCNA与反义bcl-2脱氧寡核苷酸抑制人视网膜色素上皮生长

目的　观察反义增生细胞核抗原 (PCNA)和反义 bcl-2脱氧寡核苷酸对培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPE)生长的作用 .方法　用 DNA合成仪合成有 1 8个核苷酸的反义PCNA和 1 5个核苷酸的反义 bcl- 2脱氧寡核苷酸片段 ,以不同浓度加入 RPE培养液 ,培养 2～ 4d,用 SABC法检测细胞PCNA和 bcl- 2的表达 ,用 MTT法及流式细胞仪测定细胞抑制率 .结果　 6 .2 5～ 1 0 0μm ol· L- 1 的反义 PCNA对 RPE的抑制率为 8.3%～ 38.4% ,呈剂量依赖性 ,并抑制细胞 PCNA的表达 .反义 bcl- 2未显示抑制作用 .结论　反义 PCNA脱氧寡核苷酸可抑制近 40 %的 RPE生长 ,其临床应用值得进一步研究     

cFLIP反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞SW620的增殖

目的 研究cFLIP反义寡核苷酸(cFLIP-asODN)对人结肠癌细胞株SW620细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将cFLIP-asODN转染入SW620细胞,并设空载体+cFLIP-asODN转染组、脂质体+无意义ODN转染组和空白对照组作为对照.荧光倒置显微镜检测复合物对细胞的转染效率;荧光实时定量RT-PCR和...     

垂体瘤转化基因反义寡核苷酸抑制胶质瘤增殖的实验研究

目的 观察垂体瘤转化基因(pituitary tumortr ansforming gene,PTTG)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对恶性胶质瘤增殖的抑制作用.方法 将C6胶质瘤细胞接种于大鼠右侧尾状核.按照不同的PTTG反义寡核苷酸浓度在选定的时间点立体定向原位注射于肿瘤区域.3周后处死大鼠,取标本做GFAP、PTTG、PCNA免疫组化染色.结果 不同浓度的PTTG-ASODN对C6胶质瘤模型的增殖抑制呈时间、浓度依赖性,而且高浓度,早期应用,反复应用PTTG-ASODN抑制胶质瘤模型肿瘤增殖的效果明显.结论 PTTG-ASODN可以抑制胶质瘤的增殖,有望成为胶质瘤基因治疗的一种新策略.     

脂质体技术促进c—myc反义寡核苷酸导入人体肝癌细？…

目的 观察脂质体技术促进ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸导入人体肝癌细胞的作用。方法 采用新一代脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔ＾ＡＭＮＥ（ＬＲ）包裹针对肝癌表达基因ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）,借助ＦＩＴＣ荧光标记ｃ－ｍｙｃ－ＡＳＯＤＮ,应用细胞培养方法及荧光分光光度计以及荧光显微镜。结果 ＬＲ促进ＡＳＯＮ进入靶细胞并增强其对肿瘤细胞基因的特异性封闭作用。结论 脂质体作为一种安全、简便、有效的基因转移载体广     

脂质体包裹DNMT1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

目的研究脂质体包裹DNA甲基转移酶(DNMT1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体(Progesterone Receptor，PR)启动子甲基化及表达的影响，探讨甲基化基因治疗的新途径。方法人工合成的DNMT1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株，用RT-PCR检测DNMT1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果用MG88转染白血病细胞株后，DNMT1 mRNA显著下降；PRA、PRB启动子出现脱甲基化，PRB mRNA表达显著上升。结论DNMT1反义寡核苷酸MC88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化，使PRB mRNA表达升高，为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。     

反义硫代脱氧寡核苷酸体外抑制CVB持续感染的研究

目的：了解21聚体反义硫代脱氧寡核苷酸（AODN）体外对CVB3、CVB5持续感染的抑制作用。方法：人工合成AODN,进行脂质体包埋,并按不同浓度分别加入CVB3-ECV304、CVB5-ECV304持续感染细胞模型。对药物作用后持续感染细胞模型,观察其培养上清液致Vero细胞病变能力的改变;ELISA法检测CVB3、CVB5抗原产生的抑制率：RT—PCR检测细胞内病毒RNA表达情况;ELISA检测培养上清液分泌TNF—α浓度。同时进行正义和随机寡核苷酸（SODN、RODN）抗病毒能力检测,并与AODN结果比较。结果：AODN可抑制持续感染CVB3、CVB5抗原合成,随药物浓度的增高,抗原抑制率也升高;经AODN作用后,持续感染细胞培养上清液致Vero细胞病变能力下降．上清液中病毒滴度减少;RT-PCR在经AODN作用的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304组中未检测到病毒RNA;经AODN作用后．持续感染的CVB3-ECV304、CVB5-ECV304细胞产生TNF-α浓度升高：针对CVB3 5＇端非编码区基因组序列合成的AODN对CVB5持续感染也有较强的抑制作用;AODN对持续感染病毒的抑制作用强于SODN和RODN组。结论：AODN能体外抑制CVB3、CVB5持续感染,刺激细胞合成TNF-α。这种作用有序列特异性。但同组间病毒有交叉抑制作用,这种作用可能与CVB3、CVB5基因序列同源有关。     

转化生长因子-β1反义寡核苷酸对人横纹肌肉瘤细胞RD增殖的影响

目的 研究转化生长因子（TGF）-β1反义寡核苷酸（ASON）对人胚胎性横纹肌肉瘤细胞系RD增殖的影响。方法 采用反义寡核苷酸技术，以阳离子脂质体为载体，将人工合成的TGF-β1 ASON转染RD细胞，阻碍内源性TGF-β1／Smad信号的转导，以未转染的RD细胞组作对照。免疫荧光技术检测RD细胞TGF-β1蛋白表达水平；四甲基偶氮唑盐实验（MTT）检测RD细胞的增殖情况；流式细胞术（FCM）检测细胞周期。结果 转染4d后RD细胞TGF—β1蛋白表达量较转入2d时明显减少，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；RD细胞活力明显降低，合成期（S期）细胞减少。结论TGF-β1 ASON可有效阻碍TGF—β1／Smad信号通路，在一定程度上可促进RD细胞退出细胞周期，并抑制RD细胞增殖。     

阳离子脂质体对反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒作用的促进

目的 :考察阳离子脂质材料 3β [N (N′,N′ 二甲基胺乙基 )胺基甲酰基 ]胆固醇 (3β [N (N′,N′ dimethylaminoethane) carbamoyl]cholesterol,DC chol)与反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotide ,asODN)的结合能力及asODN阳离子脂质体的细胞毒性和抗病毒活性。方法 :以DC chol从水相中萃取asODN的萃取率评价不同条件下DC chol与asODN的作用力 ;通过四唑盐比色法检测含DC chol的阳离子脂质体对HepG2 2 .2 .1 5的细胞毒性 ;以酶联免疫法 (ELISA)检测细胞上清培养液中HBsAg和HBeAg的含量 ,考察不同asODN阳离子脂质体的抗病毒活性。结果 :当正负电荷比 >0 .6时 ,DC Chol能有效的从水相中萃取asODN (萃取率 80 %～ 1 0 0 % ) ;碱性条件和强离子 (Na+ /Cl-)的存在不利于DC Chol与asODN的作用 ;DC chol阳离子脂质体具有一定的细胞毒性 ,在低质量浓度时 (0 .84～ 2 6 .94mg·L-1 )脂质体的细胞毒性与DC chol浓度成正比 ;当asODN在 1 .2 5～ 5 .0 0 μmol·L-1时 ,其抗病毒活性与剂量相关 ;脂质体可提高asODN对乙肝病毒的抗病毒活性 ,其中阳离子脂质体对asODN抗病毒活性的促进作用较明显 (从 6 0 %到 95 % )。结论 :表面修饰DC Chol阳离子脂质体能有效地促进asODN的抗乙肝病毒活性。     

MMP-9反义寡核苷酸抑制胃癌细胞生长的实验研究

目的探讨MMP-9反义寡核苷酸作为靶基因对胃癌细胞的生长抑制效应,以进一步揭示MMP-9反义寡核苷酸治疗胃癌的可能性和可行性。方法以人胃癌细胞株MGC803为研究对象,应用ASODN技术,将MMP-9ASODN转染到MGC803细胞中,利用MTT法检测不同浓度不同时间MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测分析MMP-9反义寡核苷酸对MGC803细胞周期及凋亡的影响。结果MMP-9反义寡核苷酸在体外能够抑制MGC803肿瘤细胞增殖,且这种增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性;MMP-9反义寡核苷酸在体外能够诱导MGC803肿瘤细胞凋亡,作用与浓度和时间有关。结论MMP-9反义寡核苷酸可望成为一种人胃癌临床有效的治疗方法。     

阳离子脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸促进对HeLa细胞生长的抑制作用

目的 考察阳离子脂质体(CL)为载体的反义寡核苷酸(ASODN)序列对HeLa细胞的抑制作用.方法 选择以人端粒酶模板RNA(hTR)和人逆转录酶催化亚基(hTERT)为靶点的两种ASODN,用3β[N-(N‘,N‘-二甲氨基乙基)氨甲酰基]-胆固醇(DC-Chol)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)制备CL,考察其形态和粒径分布,并用其介导反义寡核苷酸转染HeLa细胞,通过噻唑蓝比色法(MTT)研究对细胞的抑制作用.结果 CL外观呈圆形,粒径均匀,在体外能够有效转染反义hTR和反义hTERT寡核苷酸序列(anti-hTR,anti-hTERT).CL/ASODN处理后的HeLa细胞,72 h后的存活率为(19.82&#177;12.19)%(antihTR,2.0 μmol&#183;L-1)和(16.59&#177;4.10)%(anti-hTERT,2.0 μmol&#183;L-1),而相同浓度游离的ASODN没有发现抑制作用.CL/ASODN复合物能够在120 h内持续抑制HeLa细胞的生长.结论 CL能够有效提高ASODN对HeLa细胞的抑制作用,作为端粒酶抑制剂的新型非病毒载体,具有良好的应用前景.     

反义寡核苷酸抑制肝癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 研究血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）反义寡核苷酸（ＯＤＮ）抑制人肝癌细胞系ＶＥＧＦ的表达,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系７７２１能表达ＶＥＧＦ,采用人工合成反义、正义ＯＤＮ分别作用于７７２１细胞,免疫组化图像分析方法比较各处理组ＶＥＧＦ的表达情况,即可了解ＶＥＧＦ反义ＯＤＮ抑制肝癌的血管形成情况。结果 ＶＥＧＦ反     

反义寡核苷酸抑制端粒酶活性对喉癌细胞癌细胞表达的影响

目的 探讨针对端粒酶的反义寡核苷酸对喉癌细胞端粒酶活性的抑制及对P53和PCNA基因表达的影响。方法 用PCR－ELISA法检测喉癌细胞株Hep-2细胞内端粒酶的活性，用免疫组化的方法检测喉癌细胞P53和PCNA基因的表达。结果 该反义寡核苷酸可抑制喉癌细胞端粒酶活性，此作用有序列特性性和浓度依赖性。40μM反义核苷酸抑制了喉癌细胞PC－NA的表达，而对P53表达无明显影响。结论 靶向于端粒酶的反义寡核苷酸能抑制喉癌细胞Hep-2PCNA基因的表达。     

反义寡核苷酸抑制整合素αv亚基表达对喉癌细胞侵袭和增殖的影响

目的应用反义寡核苷酸体外细胞转染技术抑制喉癌细胞整合素αv(integrin αv,ITGAV)表达,探讨ITGAV表达抑制对喉鳞癌Hep-2细胞侵袭和增殖能力的影响。方法设计合成特异性靶向整合素αv的反义寡核苷酸序列(antisense oligonucleotides sequence,ASONs),用阳离子脂质体包被并转染喉鳞癌Hep-2细胞,免疫荧光技术检测转染前后整合素αv亚基的蛋白表达,MTT法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况,Boyden小室法检测转染前后喉癌细胞的侵袭能力。结果靶向整合素αv的ASONs对喉鳞癌细胞株的侵袭和增殖能力具有明显的抑制作用,并具有剂量-时间依从性。结论靶向整合素αv的ASONs能够抑制喉鳞癌细胞株生长,并使其侵袭能力减弱,整合素αv可能成为喉鳞癌基因治疗的新靶点。     

阳离子脂质体介导的反义c-myb寡核苷酸对脑胶质瘤生长的抑制作用研究

目的　观察阳离子脂质体 lipofect AMINE介导的反义 c- myb寡核苷酸 (L ipo AON)对肿瘤生长的影响。方法　取雄性 Wistar大鼠 48只 ,行脑内 C6胶质瘤接种 ,术后 6天 ,将携瘤大鼠随机分成 L ipo AON组、反义 c- myb寡核苷酸组 (AON组 )、阳离子脂质体 lipofect AMINE组 (L ipo组 )和生理盐水对照组 (NS组 ) ,每组各 12只。经大鼠右股静脉给药 ,间隔 1天后 ,再次用同法经大鼠左股静脉等量给药。给药后严密观察各组大鼠饮食、四肢活动及体重变化情况 ,并于给药后第 4天和第 10天每组分别处死 6只大鼠 ,进行肿瘤的生长情况和大体形态学观察。结果　 L ipo AON组在静脉给药期间及停药后的短期内其肿瘤生长被明显抑制 ,c- m yb表达下调 ;而 AON组、L ipo组与 NS组相比 ,其肿瘤生长未见抑制现象 ,c- myb表达亦未见下调。但随着停药时间的延长 ,L ipo AON对肿瘤的抑制作用下降。结论　 1阳离子脂质体 L ipofect AMINE作为 c- m yb AON转移载体 ,使水溶性 c- myb AON容易透过 BBTB进入瘤内发挥治疗作用 ,且具有操作简单、安全、转染率高等特点 ;2 L ipo AON对 C6胶质瘤生长有明显抑制作用 ,用反义技术抑制 c- myb的表达在胶质瘤的治疗中具有研究前景 ;3 L ipo AON对胶质瘤生长的抑制作用随时间延长而下降 ,如何让     

CTGF反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞胶原Ⅲ分泌的影响

目的 观察结缔组织生长因子（CTGF）反义寡核苷酸对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞NRK52E胶原Ⅲ分泌的影响。方法 采用脂质体介导的方法将CTGF反义寡核苷酸导入细胞，转化生长因子β1（TGF-β1）刺激48h后，用RT-PCR、ELISA法观察CTGF和胶原Ⅲ的表达。结果 TGF-β1能够诱导NRK52E细胞表达CTGF并进而促进胶原Ⅲ的分泌，CTGF反义寡核苷酸导入细胞后可以大部分取消TGF-β1，的作用，而对照组的寡核苷酸没有此作用。结论 CTGF反义寡核苷酸能够特异地抑制CTGF的表达，进而阻止细胞外基质的生成，这可能是治疗肾间质纤维化的一条新途径。     

大肠癌组织中TGF-α、TGF-β1的表达及其意义

目的 :探讨转化生长因子α(TGF α)和转化生长因子 β1(TGF β1)在大肠癌组织中表达的相关意义。方法 :应用免疫组织S P法对大肠癌细胞进行检测。结果 :TGF α、TGF β1在大肠癌中的阳性表达率分别为6 2 .90 %和 6 9.35 % ,明显高于二者在大肠腺瘤、正常粘膜中的表达 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,癌旁粘膜中的表达高于正常粘膜 (P <0 .0 5 ) ;TGF α在高、中分化腺癌中的表达低于低分化腺癌 (P <0 .0 5 ) ;DukesA +B期中二者的表达低于DukesC +D期 (P <0 .0 5 ) ;二者在大肠癌中的表达有相关性 (P <0 .0 5 ,Pearson列联系数 =0 .4 1)。结论 :大肠癌TGF α、TGF β1过度表达与大肠癌发生、发展、Dukes分期、癌组织浸润、转移范围有关 ;TGF α与腺癌分化程度有关 ;少部分大肠癌旁粘膜已偏离正常细胞生长状态 ,具有肿瘤细胞生长代谢的某些特征。