miR-34a-5p对KSHV感染的神经细胞增殖和迁移能力的影响

目的研究miR-34a-5p对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)感染的神经细胞增殖和迁移能力的影响。方法选择KSHV感染的SH-SY5Y神经细胞(SK-RG)和SH-SY5Y细胞,进行差异表达的miRNA转录组测序和生物信息学分析,通过qRT-PCR法验证SH-SY5Y、SK-RG中miR-34a-5p表达水平。采用Lipofectamine 2000分别将miR-34a-5p mimics与miR-NC转染至SK-RG细胞,qRT-PCR检测转染效果。采用MTT法及平板克隆实验检测细胞增殖能力。通过Transwell及划痕实验比较两组细胞的迁移能力。采用Target Scan分析miR-34a-5p与候选靶基因c-fos基因3'UTR区的结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-34a-5p和c-fos 3'UTR区的靶向调控关系以分析其作用机制。采用Western blot在转染miR-34a-5p mimics与miR-NC的细胞中检测靶基因c-fos的表达。结果转录组测序结果及qRT-PCR验证均提示,SK-RG细胞中miR-34a-5p的水平低于SH-SY5Y细胞(P0.05)。于SK-RG细胞中过量表达miR-34a-5p后,MTT和平板克隆实验结果表明miR-34a-5p组细胞增殖能力低于miR-NC对照组(P0.05)。Transwell和细胞划痕实验结果表明,miR-34a-5p组细胞迁移能力低于miR-NC对照组(P0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果提示miR-34a-5p可通过3'UTR区调控c-fos的表达。Western blot结果显示,miR-34a-5p可负向调控c-fos表达。结论 miR-34a-5p可能通过抑制c-fos的表达而抑制KSHV感染的神经细胞的增殖和迁移能力,可能成为治疗KSHV感染相关疾病的小分子miRNA候选药物。     

miR-193b通过负向调控MCT7基因的表达抑制人胶质瘤U251细胞的迁移与侵袭

为探讨miR-193b对人胶质瘤U251细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用HiPerFect转染试剂瞬时转染miR-193b模拟物(mimics)上调U251细胞中miR-193b的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率,然后进行细胞划痕实验及侵袭实验,分别检测miR-193b对U251细胞迁移及侵袭能力的影响.结果显示过表达miR-193b可抑制U251细胞迁移和侵袭的能力.应用生物信息学软件预测,提示单羧酸转运蛋白7(MCT7)基因可能是miR-193b的潜在靶基因.进而构建双荧光素酶报告基因系统从转录水平上证明MCT7为miR-193b调控的靶基因;qRT-PCR及蛋白质免疫印记(Western blot)分别在mRNA和蛋白水平上进一步证明MCT7基因的表达受miR-193b的负调控.由此可见,miR-193b很可能通过负向调控MCT7基因的表达来抑制U251细胞的迁移与侵袭.     

与肺癌侵袭转移相关的miR-424-5p靶基因的预测及鉴定

为研究miR-424-5p参与肺癌侵袭转移的分子机制,筛选与肺癌侵袭转移相关的miR-424-5p靶基因,采用文献调研分析miR-424-5p与肺癌侵袭转移相关的靶基因,并用生物信息学方法筛选miR-424-5p与靶基因3′UTR结合分数较高的靶基因;结合二者的交集筛选出部分靶基因,构建含靶分子3′UTR的荧光素酶报告基因质粒;分别将miR-424-5p模拟物(mimic)与含有靶分子3′UTR的荧光素酶报告基因质粒共转染293T细胞,进行荧光素酶报告基因实验鉴定靶基因。生物信息学分析表明,与肺癌侵袭转移信号通路相关的基因之一是细胞因子信号传导抑制子5(Suppressor of cytokine signaling 5,SOCS5)。在miR-424-5p mimic或阴性对照(negative control,NC)与野生型靶分子SOCS5 3′UTR双荧光素酶报告基因载体共转入293T细胞后,荧光素酶活性值降低至NC组的46%(P0.01)。而miR-424-5p mimic与靶分子3′UTR突变型报告基因载体共转后,荧光素酶的活性与对照组相比几乎无改变。表明SOCS5可能是miR-424-5p的肺癌侵袭转移相关的一个靶分子。     

环状RNA Circ-CCND1靶向miR-224-3p/SIRT1轴对食管癌细胞生物学行为影响

为了解环状RNA细胞周期蛋白D1(circ-CCND1)靶向微小RNA(miR)-224-3p/沉默信息调节因子1(SIRT1)轴对食管癌细胞生物学行为的影响.利用q RT-PCR检测食管癌组织和细胞中circ-CCND1、miR-224-3p、SIRT1 m RNA表达水平;生物信息学、双荧光素酶实验、pull down实验、RIP实验验证circ-CCND1、SIRT1与miR-224-3p靶向关系;EdU、CCK-8法测定细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测SIRT1、Bcl-2、Bax、MMP9蛋白表达.结果表明,circ-CCND1、SIRT1在食管癌组织和细胞表达升高,miR-224-3p表达降低(P<0.05),选择ECa-109细胞进行后续实验;生物信息学、双荧光素酶实验、pull down实验、RIP实验证实circ-CCND1、SIRT1与miR-224-3p存在靶向关系;沉默circ-CCND1或过表达miR-224-3p可显著抑制ECa-109细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡(P<...     

miR-221-3p在PTC中的表达及对BCPAP细胞增殖、凋亡的影响与KEGG、GO分析

目的:观察miR-221-3p在乳头状甲状腺癌(PTC)中的表达,分析其与分期、转移的关系,瞬时转染miR-221-3p inhibitor观察其对PTC细胞BCPAP的增殖和凋亡的影响,生物信息学方法分析miR-221-3p可能作用的靶基因、参与的通路及功能.方法:(1)原位杂交法(ISH)检测PTC、滤泡状甲状腺癌(FTC)与正常甲状腺组织中miR-221-3p的表达.(2)miR-221-3p inhibitor瞬时转染BCPAP细胞后与阴性对照组比较,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法、噻唑蓝(MTT)法、Annexin V-FITC/PI流式法分别检测两组细胞miR-221-3p表达、细胞增殖、凋亡情况.(3)软件预测miR-221-3p的靶基因,进行KEGG及GO富集分析.结果:(1)ISH显示PTC组织中miR-221-3p表达明显上调,与FTC、正常甲状腺组织相比差异有统计学意义(P0.01);(2)miR-221-3p inhibitor转染细胞后,细胞miR-221-3p表达下降;细胞增殖减慢,细胞凋亡无明显改变.(3)在PTC中,KEGG分析显示miR-221-3p的靶基因参与了Wnt signaling pathway、Pathways in cancer等通路,GO分析显示miR-221-3p具有细胞代谢调控、基因表达调控、RNA代谢调控等生物功能.结论:miR-221-3p在PTC中表达明显上调,可能成为PTC的一种标志物,可能有影响PTC细胞增殖的作用,参与了Wnt signaling pathway、Pathways in cancer等通路,对PTC细胞的代谢、基因表达等功能具有重要影响.     

胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因预测及生物信息学分析

目的：研究胃癌耐药相关hsa-miR-194-5p的靶基因，并分析其参与的生物学过程和信号转导通路，为胃癌耐药机制的表观遗传学研究提供前期基础.方法：通过NCBI数据库检索hsa-miR-194-5p的基本信息；使用预测数据库预测hsa-miR-194-5p的靶基因；使用DAVID数据库对靶基因集合进行功能富集分析(GO)和信号转导通路富集分析(KEGG).结果：成熟的miR-194-5p序列多个物种之间具有高度保守性.预测靶基因共325个，参与的生物学过程主要有Golgi组织和细胞对DNA损伤刺激的反应(P<0.01),分子功能包括泛素蛋白连接酶结合和泛素介导的蛋白水解(P<0.01),细胞组分富集在细胞核和细胞表面，调控包括TGF-β和WNT等多条信号转导通路(P<0.01).结论：miR-194-5p的靶基因SMURF1、 RAC1、MAPK1与胃癌细胞的增殖密切相关.     

miR-194-5p通过Wnt5a抑制肝星状细胞活化

为研究miR-194-5p对肝星状细胞(HSCs)活化的影响及作用机制,采用CCK-8、β-半乳糖苷酶染色、Transwell、划痕、集落形成实验和RT-qPCR、Western blot分别检测miR-194-5p对LX-2细胞生物学特性、细胞活化标志物和靶基因表达的影响,并用生物信息学和双荧光素酶报告实验确定miR-194-5p靶基因.结果显示：miR-194-5p抑制LX-2细胞增殖、细胞集落形成、迁移能力以及LX-2细胞中活化标志物的表达,促进LX-2细胞衰老;Wnt5a为miR-194-5p的直接靶基因.研究表明miR-194-5p通过靶定Wnt5a抑制LX-2细胞活化,miR-194-5p和Wnt5a可能是治疗肝纤维化新的靶点.     

MicroRNA-409-3p通过靶向ZEB1促进HCMV感染的胶质瘤细胞迁移的机制研究

近年来的临床研究显示人巨细胞病毒(HCMV)与神经胶质瘤关系密切,但HCMV促进胶质瘤进展的机制仍未阐明,而microRNA(miRNA)在神经胶质瘤中被检测到异常表达,因此提出潜伏感染的HCMV会通过调节宿主细胞miRNA从而影响神经胶质瘤发生发展的假设。首先通过转录组分析和细胞实验,证实miR-409-3p在HCMV感染后显著下调。生物信息学预测显示锌指结合蛋白1(ZEB1)为其下游靶基因。miR-409-3p过表达后的细胞划痕实验以及Transwell迁移实验证实,miR-409-3p的过表达会导致ZEB1下调并抑制胶质瘤U87细胞迁移,而外源性过表达ZEB1可恢复U87细胞迁移能力。研究结果表明,潜伏感染的HCMV能够通过下调宿主细胞中miR-409-3p,从而上调ZEB1表达,促进神经胶质瘤细胞迁移。     

数据挖掘结合实验证明hsa-miR-371a-3p促进肝癌细胞迁移

肝细胞癌严重威胁着人类的生存,其转移是肝癌患者主要的死亡原因.microRNA参与调控肿瘤的转移,具有成为治疗靶点的潜力.本研究通过生物信息学的手段挖掘公共数据库中的microRNA表达谱数据,鉴定出新的潜在的促进肝癌转移的microRNA hsa-miR-371a-3p.细胞愈伤实验和细胞迁移实验的结果证明hsa-miR-371a-3p的过表达能够促进肝癌细胞的迁移.而且,在hsa-miR-371a-3p过表达的肝癌细胞中,预测的靶基因MRVI1和UBR7的mRNA表达水平下降,说明hsa-miR-371a-3p可能通过下调MRVI1和UBR7的方式促进肝癌细胞的迁移.     

miR-9-5p靶向调控ZAK对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:阐明miR-9-5p通过靶向调控ZAK表达从而影响结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法:通过qPCR、Western blot检测结直肠癌细胞系(HCT116、SW260、HT29及LoVo)及结直肠癌患者组织样本中miR-9-5p表达水平及ZAK的mRNA和蛋白表达水平。生物信息学方法分析miR-9-5p与ZAK结合的靶向序列。双荧光素酶基因报告实验检测miR-9-5p对ZAK的靶向调控关系。脂质体法将miR-9-5p mimic或/和ZAK质粒共转染结直肠癌细胞系HCT116及SW620,通过CCK-8及克隆形成实验观察miR-9-5p/ZAK信号轴对细胞增殖的影响，通过Transwell观察对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:与人正常上皮细胞系相比，在结直肠癌细胞系中ZAK的mRNA及蛋白水平显著上调(P<0.05);在结直肠癌临床组织样本中，ZAK蛋白水平亦显著上调(P<0.05);miR-9-5p的表达水平在癌细胞系及组织样本中下调(P<0.05)。双荧光素酶报道基因实验显示miR-9-5p能显著影响ZAK 3’UTR野生型表达载体的荧光素酶...     

CTCF通过抑制p53信号通路促进胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭

为了探索CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor, CTCF)对人胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭能力的影响及其潜在的分子作用机制,利用慢病毒感染法获得稳定过表达或敲低CTCF的胆管癌细胞系,采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting, Wb)检测CTCF蛋白表达水平,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和克隆形成实验检测细胞生长情况,采用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,采用GraphPad软件(v6)的Mann-Whitney U检验分析CTCF基因在癌和癌旁组织间的mRNA差异表达.结果显示:过表达CTCF可显著促进HCCC-9810和RBE胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭能力;敲低CTCF呈现相反的表型.通过通路富集分析发现:CTCF的表达水平在胆管癌中与p53信号通路活性显著负相关,过表达CTCF可显著下调p53及其靶基因p21的mRNA和蛋白表达水平,而敲低CTCF则显著促进p53和p21的mRNA和蛋白表达水平.综上,本研究揭示CTCF可能通过抑制p53信号通路而促进胆管癌细胞生长、迁移和侵袭而发挥促癌基因的功能.     

PPM1A抑制胰腺癌细胞PANC-1的迁移侵袭和EMT进程

为研究镁依赖性蛋白磷酸酶1A(protein phosphatase magnesium-dependent 1A,PPM1A)对胰腺癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影响,采用生物信息学技术以及细胞免疫荧光实验分析PPM1A在胰腺癌中的表达情况,划痕、Transwell、qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光实验检测PPM1A对胰腺癌细胞PANC-1迁移、侵袭及EMT标志物表达水平的影响,生物信息学网站预测PPM1A的上游miRNA.结果表明,PPM1A在胰腺癌中低表达,抑制PANC-1细胞的迁移、侵袭和EMT进程,miR-105-5p为PPM1A的潜在上游miRNA.说明PPM1A和miR-105-5p可能是治疗胰腺癌新的靶点.     

听力损失中表达上调的miR-196a-5p靶向抑制Neuritn的表达

目的筛选鉴定听力损失中上调且靶向调控Neuritin的miRNA。方法构建CBA小鼠药物性听力损失模型(硫酸卡那霉素+呋塞米),采用高通量测序检测听力损失中差异表达的miRNA。利用生物信息学技术,分析预测靶向Neuritin的miRNA,取测序结果中高表达miRNA与靶向Neuritin的miRNA交集得到候选miRNA。使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)明确听力损失中候选miRNA高表达,使用miRNA mimics转染293T细胞,观察目标miRNA对Neuritin表达的靶向抑制作用。结果通过高通量测序与生物信息学分析获得3个在听力损失中表达升高且可能靶向调控Neuritin的候选miRNA,即miR-196a-5p,miR-211-5p和miR-6395。RT-qPCR实验发现miR-196a-5p在小鼠听力损失12h与24h后在Corti器中的均表达升高(P0.05); miR-6395在小鼠听力损失后12h表达降低,24h后表达升高(P0.05); miR-211-5p在小鼠听力损失后12h与24h表达均降低(P0.05)。Western Blot实验发现转染miR-196a-5p后293T细胞的Neuritin表达下降(P0.05)。结论听力损失中表达上调的miR-196a-5p可靶向抑制Neuritin的表达。     

藻蓝色素蛋白通过调控miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的增殖和迁移

研究藻蓝色素蛋白抑制非小细胞肺癌LTEP-a2体外增殖迁移的机制.以LTEP-a2细胞为模型,采用高通量miRNA转录组学对藻蓝蛋白处理后细胞中差异表达的miRNA进行了筛选;对筛选出的差异miRNA,利用体外转染mimics的方法对细胞的增殖、迁移能力进行验证.研究结果显示,藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后能够显著增加细胞内miR-642a-5p的表达水平;过表达miR-642a-5p能够显著抑制细胞的体外增殖、迁移能力;此外,藻蓝蛋白可以通过上调miR-642a-5p表达抑制核受体NF-κB信号通路,降低蛋白磷酸化水平,进而抑制LTEP-a2细胞的增殖迁移能力.研究能够为藻蓝色素蛋白的应用以及非小细胞肺癌的治疗提供一定的理论基础.      

不同运动强度对急性心肌梗死大鼠心功能的影响及循环miRNAs差异表达

研究不同运动强度对急性心肌梗死大鼠心功能的影响, 分析循环微小RNA(microRNAs, miRNAs)的差异表达与靶基因及基因功能. 制作急性心肌梗死大鼠模型40只,分为4组, 每组10只, 分别为假手术组、单纯心肌梗死组、中等强度持续运动(continuous moderate training, CMT)组和间歇高强度运动(high intensity interval training, HIT)组, CMT组和HIT组大鼠接受运动治疗8周, 用超声心动图评估心功能, 用基因芯片技术测定4组大鼠模型循环miRNAs差异表达, 用生物信息学技术分析不同运动强度下循环miRNAs相关靶基因及基因功能. CMT组和HIT组的治疗显著改善了心肌梗死大鼠心功能和运动耐量, HIT组显著优于CMT组. 单纯心肌梗死组与假手术组相比, 明显上调的循环miRNAs有14个, 明显下调的循环miRNAs有4个. 与单纯心肌梗死组相比, CMT组明显上调的循环miRNAs有11个, 明显下调的循环miRNAs有2个; HIT组明显上调的循环miRNAs有53个, 明显下调的关键miRNAs有41个. 与假手术组相比, 单纯心肌梗死组心肌相关循环miRNAs的差异表达有miR-26a-5p, miR-92a-3p和miR-378a-3p; 与单纯心肌梗死组相比, CMT组有miR-92a-3p, HIT组有miR-34c-3p, miR-23a-3p, miR-98-3p, miR-208a-5p和miR-92-3p. 高强度间歇运动对心肌梗死大鼠心功能和运动耐量的改善作用优于中等强度持续运动, 其循环miRNAs及心肌相关循环miRNAs的差异表达数量明显高于中等强度持续运动, 循环miRNAs差异表达有望作为运动强度和运动效果判断的分子生物学标志物.     

miR-128通过靶向p38调控树突细胞中IL-6的产生

p38 MAPK作为MAPK信号通路中关键的一类,对于树突细胞的成熟及激活等都具有至关重要的调节作用.首先利用生物信息学的方法预测了p38可能受到一系列microRNA的调控,进一步利用双荧光素酶报告载体系统证实了miR-128可直接作用于p38基因的3′非编码区域并抑制p38的表达.转染miR-128可以很显著地降低树突细胞中p38的蛋白水平,进而引起细胞因子IL-6分泌的减少.因此,利用miR-128可能是改善树突细胞抗肿瘤免疫治疗的一个新策略.     

miR-1/133基因簇的进化及其调控网络

miR-1/133基因簇在心肌和骨骼肌中特异性表达,对心脏以及骨骼肌的发育及生理病理具有重要作用.该研究采用生物信息学方法,研究了miR-1/133基因簇的进化特征,预测了其靶基因及其调控的生物学过程.利用miRBase数据库对23种不同物种间miR-1/133基因簇的序列、组织方式进行了比较.采用最大似然法构建miR-1/133基因簇的系统进化树,显示该基因簇的进化与物种进化关系有一定差异.利用在线数据库对miR-1/133基因簇上游转录因子及下游靶基因进行预测,并对其进行综合分析,绘制出该基因簇的网络调控图,表明miR-1/133基因簇参与了骨骼肌与心肌发育、胰岛素受体信号通路、经典Wnt信号通路、p53信号通路等体内重要生理过程,为进一步阐明miR-1/133基因簇的生物学功能提供了理论依据.     

大气压低温等离子体抑制甲状腺未分化癌CAL-62细胞生长的机制研究

为了探究大气压低温等离子体(CAP)抑制间变性甲状腺癌的作用机制，应用转录组测序技术，借助生物信息学分析手段研究CAP对CAL-62的抑制作用，筛选出差异基因进行KEGG富集分析和GO分类，最后选取部分基因进行Western blot (WB)验证.结果表明，与对照组相比CAP处理组共有674个差异表达基因，以BIK和CDKN1C等为代表的287个基因上调表达，以TANC2、ESM1和CBL等为代表的387个基因下调表达.KEGG富集分析表明差异基因主要富集在MAPK、Rap1等信号通路及癌症转录失调等.GO分类表明差异基因主要富集在免疫反应、细胞凋亡过程等方面.WB检测部分差异基因的变化趋势，得到与转录组相一致的结果.该研究从转录组学角度去解释CAP抑制CAL-62细胞的机制，以期为CAP应用于甲状腺未分化癌治疗提供一定的理论基础.     

藏鸡肌肉组织中3条新发现miRNA序列的克隆及靶基因预测

旨在克隆藏鸡不同发育阶段肌肉组织中新发现的差异表达的3条miRNA(miR-13_529,miR-20_1207,miR-24_1302)序列,并对它们的靶基因进行预测,为3条miRNA序列功能的研究奠定基础.随机选择150日龄健康藏鸡,屠宰并采集藏鸡肌肉组织,提取组织总RNA,利用Stem-loop RT-PCR法克隆获得藏鸡3条新发现miRNA序列,利用4个生物信息学预测软件预测3条miRNA序列的靶基因.结果表明,克隆获得miR-13_529序列23bp,miR-20_1207序列21bp,miR-24_1302序列22bp.靶基因预测结果显示,分别能与3条miRNA序列特异性结合的2个、10个和1个靶基因均与肌肉生长发育相关.这些结果表明3条新发现的miRNA序列可能在藏鸡肌肉发育的过程中具有重要的调控作用.     

MiR-17促进胃癌细胞上皮间质转化机制

目的 探讨miR-17调控胃癌细胞上皮间质转化的作用机制.方法 检测胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17的表达水平;分别将miR-17模拟物(抑制物)和TGFBR2过表达载体(siRNA)转染到SGC-7901胃癌细胞中,通过MTT法、流式细胞术、Transwell实验和Western blotting检测细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志蛋白表达;荧光素酶报告基因分析验证miR-17与TGFBR2的靶向关系.结果 胃癌组织和胃癌细胞系中miR-17表达上调;过表达miR-17促进SGC-7901细胞增殖、侵袭,抑制凋亡;miR-17靶向TGFBR2的3'UTR;过表达TGFBR2抑制SGC-7901细胞增殖、侵袭,促进凋亡;miR-17通过激活PTEN/PI3K/AKT信号通路促进SGC-7901细胞EMT.结论 miR-17靶向下调TGFBR2表达,激活PTEN/PDK/AKT信号通路,促进SGC-7901细胞EMT.体内研究结果证明miR-17促进肿瘤的生长.因此,miR-17可能是胃癌抗转移治疗的潜在策略.