基于甲型流感病毒核蛋白的抗病毒靶点研究进展

甲型流感是对人类健康和社会稳定构成极大威胁的急性呼吸道传染病,具有极高的发病率和死亡率。由于甲型流感病毒的高变异性和频繁的耐药性,使得新靶点的抗病毒药物的研发显得非常重要。甲型流感病毒的核蛋白高度保守,是一个潜在的抗病毒药物的靶点,国内外已有相关报道。中草药作为祖国的传统医学宝藏,在防治甲流方面也表现出了独特的优势。本文从甲型流感病毒结构与功能出发,阐述甲型流感病毒核蛋白作为抗病毒靶点的研究进展。     

甲型流感病毒核糖核蛋白的提纯及其部分理化性质的研究

用Triton x-100和DOC裂解、Sephadex G200柱层析和密度梯度超离心方法,首次从流感病毒感染的鸡胚尿囊膜中提纯了甲型流感病毒RNP。经蛋白质和核酸含量测定、补体结台试验、免疫双扩散及SDS—PAGF鉴定,所提纯的RNP与从病毒中提取的RNP相同。并测出粤防77—38毒株RNP的等电点为4.6,沉降系数为56．1 S。     

miR-769-3p 对甲型 H1N1流感病毒核蛋白表达的调控

目的:预测靶向甲型流感病毒核蛋白(NP)基的微小 RNA(miRNA),并检测其对 NP 表达的影响.方法:从miRBase 数据库中获取人成熟 miRNA 序列,利用 miRanda 软件预测潜在靶向流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基的人 miRNA;通过双萤光素酶报告基系统及 Western 印迹验证所预测的 miRNA 对 NP 表达的影响.结果:用 miRanda软件在流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基上预测得到分值及最小结合自由能均较好的 miR-769-3p;双萤光素酶报告基结果显示 miR-769-3p 能显著降低报告基载体萤光素酶的表达;Western 印迹结果显示 miR-769-3p 能明显抑制 NP 的表达,但突变 NP 基上的 miR-769-3p 结合位点后,miR-769-3p 不能抑制 NP 的表达.结论:miR-769-3p 可靶向流感病毒 A/FM/1/47(H1N1) NP 基并抑制 NP 的表达,为抗甲型流感病毒的 miRNA 药物研发提供了据和潜在药物靶标.     

IBV核蛋白的表达纯化及在监测中应用

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是禽类一种变异性很强的冠状病毒,为获得高度纯化的IBV核蛋白,建立监测IBV抗体的方法,通过RT-PCR从IBV中扩增IBV-N基因,定向连接到表达载体pGEX-KG中,转化E. coli BL21（DE3）菌株,诱导获得表达产物,SDS-PAGE分析产物大小、Western blot分析其免疫学活性,通过亲和层析法获得高度纯化的表达蛋白,建立一种检测IBV抗体的方法,并应用于临床监测。结果显示,IBV-N基因全长1230bp,GST融合蛋白表达产物大小约为80kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%,具有良好的免疫学活性;通过GST亲和层析柱成功获得纯化蛋白,以该蛋白包被酶标板,成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。研究表明重组N蛋白作为IBV诊断抗原,具有制备简便、特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于该病的临床监测,为该病疫情监测、发病机制研究奠定了基础。     

H3N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得H3N2亚型禽流感病毒核蛋白(NP)全长基因,并在大肠杆菌中表达,以用于对NP功能的研究。方法:从感染了H3N2亚型禽流感病毒的MDCK细胞培养液中收获病毒,提取病毒RNA,用RT-PCR扩增出NP基因的编码区序列,将其定向克隆到pTIG-TRX原核表达载体并测序,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。结果:所克隆的核苷酸片段包含了NP基因编码区完整阅读框架,编码498个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量约66000的重组蛋白。结论:克隆和表达了禽流感病毒核蛋白编码区基因,为获得大量NP以制备抗体,以及对其进行功能性研究奠定了基础。     

人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究

采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。     

人α防御素5在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化研究

采用PCR扩增大肠杆菌偏好的人α防御素5成熟肽(mHD-5)密码子序列, 并将其克隆至pMAL-p2x质粒, 构建pMAL-p2x-mHD-5表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 诱导表达, SDS-PAGE分析目的蛋白表达量并优化表达条件。经亲和层析、酶切和离子交换层析等方法分离、纯化重组mHD-5(rmHD-5)多肽。采用浊度法测定rmHD-5对细菌的抑制活性。通过优化表达条件, 获得约30%的可溶性目的蛋白表达量, 并成功纯化rmHD-5。rmHD-5对大肠杆菌标准菌株(ATCC25922)具有较强的抑制活性, 在终浓度为62.5mg/mL时, 90%以上的细胞被抑制。结果表明采用可溶性融合表达策略, 在原核表达系统中诱导表达并纯化具有生物活性的防御素是可行的途径之一。     

琼胶酶AgaD在大肠杆菌中的高效表达

摘要:【目的】构建琼胶酶AgaD的高效表达体系,优化发酵条件提高重组酶的表达量。【方法】首先根据大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性,优化并合成AgaD的基因,使其适合E.coli表达系统;考察了不同的E.coli表达宿主;根据N端法则构建了突变体;评价了培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)对重组酶表达的影响。【结果】成功构建了琼胶酶AgaD 的高效表达体系,确定了E.coli AD494(DE3)为最适表达宿主;利用N端法则提高了重组酶的稳定性,缩短了发酵时间;通过在培养基中添加CaCl2和甘氨酸(Gly)进一步提高了胞外酶产量。最终,发酵上清中重组酶的活力由20 U/L提高至11300 U/L,比优化前提高了500余倍。【结论】构建了琼胶酶AgaD的高效表达体系,为GH96家族琼胶酶的深入研究奠定了基础。     

甜蛋白Monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长 294bp的 monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体Pet_22b中,构建重组分泌型表达载体Petmo。经IPTG诱导Petmo所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8％。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。得到的甜蛋白热稳性及耐酸性均比天然产物有所提高。     

原核系统可溶性表达策略

获得大量目的蛋白的最简单最经济的方法是利用原核表达系统表达外源基因.但由于原核系统的自身特点,使所表达的蛋白常常形成无活性的包涵体.多年来世界各国的研究为解决这一问题尝试了多种方法.本简单介绍原核表达系统的特点及提高蛋白可溶性表达的常用方法.     

利用大肠杆菌表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白

目的：通过在大肠杆菌中分段表达禽流感病毒聚合酶酸性蛋白（PA蛋白）,探索PA基因中可能影响表达的区域。方法：构建分段缺失的PA蛋白突变体,用IPTG在大肠杆菌RosettaGamiB（DE3）中诱导表达,比较各突变体的表达效率。结果：N端缺失长度在143～408个氨基酸残基之间的9个突变体在大肠杆菌中的表达水平较高;而突变体PA/K（Δ1-40aa）、PA/M（Δ1-56aa）、PA/N（Δ41-56aa）和PA/P（Δ57-75aa）的表达水平很低;全长PA蛋白和缺失N端20个氨基酸残基的突变体PA/L则检测不到表达。结论：PA基因的61～225bp和325～426bp可能是影响PA蛋白表达的2个重要区域,为下一步表达全长PA蛋白奠定了基础。     

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的:获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果:肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论:采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。     

流行性感冒病毒M2蛋白可溶性表达及其免疫原性的研究

流行性感冒（流感）的M2蛋白是其保护性抗原之一,在几科所有甲型流感病毒中高度保守,因此可以用来研究具有交叉保护能力的流感疫苗。然而M2分子在病毒颗粒中含量非常少,用从病毒中纯化的方法很难获得足够的免疫原。在原核表达时发现,M2蛋白对宿主菌具有很强的毒性作用,导至其死亡,因此很难获得高表达。在本研究中,采用RT－PCR方法从病毒感染的MDCK细胞中克隆了A1／PR／8／34毒株的M2基因,然后通过基因工程手段缺失了M2蛋白的跨膜区26－55位氨基酸的编码序列,将其克隆以pET-32a中,与硫氧还蛋白融合,在大肠杆菌中获得了高效表达,并且表达产物以可溶形式存在,不形成包涵体。利用硫酸铵盐析结合金属离子鏊和柱亲和层析的方法纯化了表达的融合蛋白。免疫荧光实验表明,融合蛋白免疫小鼠后产生的抗血清能够与流感病毒感染的细胞发生特异性的结合,证明表达产物具有流感病毒M2蛋白的抗原性。     

H5N1型禽流感病毒核蛋白C端缺失削弱核蛋白间的相互作用

目的：克隆H5N1型禽流感病毒的核蛋白（NP）基因,将其定向插入双分子荧光载体,在细胞水平验证NP-NP的相互作用,进而确定NP-NP相互作用的关键区域。方法：根据双分子荧光互补（BiFC）实验的载体和NP基因序列设计引物,将NP的结构基因定向克隆到荧光载体上,得到重组荧光载体pBiFC-YC155-NP、pBiFC-YN155-NP、pBiFC-YC173-NP和pB-iFC-YN173-NP,瞬时转染293FT细胞,研究NP-NP相互作用;进一步对NP的C端进行缺失突变,然后定向克隆到pBiFC-YN173载体,令其分别与pBiFC-YC155-NP共转染293FT细胞,确定NP的C端在NP-NP相互作用过程中的地位。结果：构建了NP基因的BiFC载体pBiFC-YC155-NP、pBiFC-YN155-NP、pBiFC-YC173-NP和pBiFC-YN173-NP;将pBiFC-YC155-NP和pBiFC-YN173-NP、pBiFC-YC173-NP和pBiFC-YN173-NP共转染293FT细胞后出现了荧光;缺失实验表明,NP的C端是NP在体内相互作用形成寡聚体所必需的。结论：验证了H5N1型禽流感病毒NP在体内的相互作用,并初步证明NP的C端是NP形成寡聚体的必需片段,为进一步研究NP的作用奠定了基础。     

TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与GST的融合蛋白并进行纯化。方法:采用PCR方法从肝文库中扩增编码TRAF6的DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST-TRAF6原核表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST-TRAF6融合蛋白。结果:酶切鉴定和测序分析显示,长为1569 bp的TRAF6 DNA片段在pGEX-4T-2-TRAF6中的碱基序列、插入位点及读框正确,且位于表达载体的GST序列下游;经IPTG最佳浓度0.5 mmol/L诱导表达、亲和纯化后,获得了相对分子质量约85×103的GST-TRAF6融合蛋白。结论:构建了重组GST-TRAF6原核表达载体,获得了GST-TRAF6的大肠杆菌BL21表达菌株及GST-TRAF6融合蛋白,利于深入研究TRAF6的功能。