选择适宜的灌注去细胞方法应用于全肝脏去细胞支架的制备

目的：对比低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）和1％ Triton X-100对制备大鼠肝脏去细胞支架（DLBS）的影响,建立一种简单且适宜的DLBS的制备方法。方法将低浓度SDS（0．25％、0．50％）和1％ Triton X-100分别加入大鼠肝脏去细胞流程,通过免疫荧光及扫描电子显微镜观察支架结构,并对支架内成分进行定量分析,再通过四氮唑盐比色法（MTT ,Assay）观察支架对C3A的细胞毒性。结果 0．25％ SDS和0．50％ SDS处理组的DNA定量均小于50 ng／mg干质量,并且糖胺聚糖在0．25％SDS和1％ T riton X-100处理组的定量要高于0．50％ SDS处理组。同时,M T T 实验表明3种方法处理后的去细胞支架对于C3A细胞的生长无毒性作用。结论应用0．25％ SDS在5 mL／min灌注流速下去细胞能够制备更为理想且有效的DLBS ,从而为器官再生打下基础。     

异丙肾上腺素在去细胞化肝脏再细胞化过程中的作用研究

目的 通过制备去细胞化肝脏生物支架,研究自主神经递质对再细胞化过程的影响.方法 使用全器官灌注法制备C57小鼠去细胞化肝脏生物支架,行HE和Massion染色鉴定并检测DNA残留量;RT-PCR和免疫荧光化学检测再细胞化肝脏中种子细胞(L02细胞株)肾上腺素能受体及亚型表达情况;检测平面以及生物支架内异丙肾上腺素对种子细胞增殖的作用,以及对再细胞化肝脏白蛋白分泌和尿素合成水平的影响.结果 成功制备去细胞化肝脏生物支架,L02细胞株表达肾上腺素能受体,并且β2受体亚型表达相对较高;异丙肾上腺素显著促进平面及再细胞化肝脏内L02细胞株增殖,并增强再细胞化肝脏分泌白蛋白和尿素.结论 异丙肾上腺素可促进去细胞化肝脏生物支架再细胞化进程.     

去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

去细胞化技术在全肝生物支架建立中的应用

目的 通过去细胞化技术建立保留细胞外基质的完整肝脏支架,并对支架进行形态结构和保留成分鉴定.方法 通过门静脉插管,依次灌注去垢剂曲拉通X-100(Triton X-100),十二烷基硫酸钠(SDS),并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱残留去垢剂,对所得支架进行HE染色、门静脉及月日道铸型、扫描电镜、纤维成分染色鉴定等形态学观察.并将支架切成50 μm的厚度后与C3A细胞系共培养,进行生物相容性验证.结果 经本实验方案得到肝脏生物支架的成功率为75%.肝脏生物支架包膜完整,肉眼可见肝脏内Gllisson管道结构.HE染色示无细胞及胞核残存.管道铸型见胆道、门静脉完整,无铸型液溢出.扫描电镜示大量纤维网状结构存在.纤维成分染色见大量胶原纤维、弹力纤维存在.生物相容性实验初步显示该支架具备较好的生物相容性,可以作为生物支架材料应用.结论 经本实验去细胞化过程,肝组织细胞可从细胞外基质中完全洗脱下来,并保留比较完整的肝脏管道系统.本研究获得全肝生物支架可以作为肝脏器官培养的基础支架.     

大鼠子宫去细胞化支架的制备和评价

目的：通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体。方法：选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通（TritonX-100）联合十二烷基硫酸钠（SDS）的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架。并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价。结果：成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为（45.6±7.3）ng/mg,不足正常子宫的5%（P＜0.01）,美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的（0.57±0.12）μg/mg增加到去细胞化子宫支架的（0.88±0.10）μg/mg,差异有统计学意义（P＜0.05）,结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性。结论：本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体。     

去细胞猪主动脉瓣膜支架的生物学特性

目的探讨以Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞后的组织工程心脏瓣膜支架的生物学特性。方法经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶处理新鲜猪主动脉瓣膜,去除内皮细胞和间质细胞,常规苏木精伊红染色,电子扫描显微镜检查,评价去细胞效果,并检测去细胞瓣叶的力学特性、可溶性蛋白含量、同时行兔皮下包埋实验,观察其免疫反应性。结果Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶能有效去除细胞成分,获得组织工程心脏瓣膜支架。去细胞瓣叶与新鲜瓣叶有相同的拉伸强度-拉伸率曲线。可溶性蛋白含量明显降低,去细胞瓣叶的免疫反应性明显降低。结论经Triton-X100、脱氧胆酸钠和核酸酶去细胞处理的猪主动脉瓣膜可以做为组织工程瓣膜支架。     

聚乙二醇去细胞化组织工程带瓣管道的物理特性

目的探讨聚乙二醇（PEG）法在生物带瓣管道准备中的应用价值，比较PEG去细胞前后带瓣管道的物理特性。方法猪主动脉瓣带瓣管道分为去细胞组和正常对照组，去细胞组用PEG和DNaseI处理，苏木精-伊红染色观察去细胞情况．DNA含量测定，计算去细胞百分率；猪主动脉带瓣管道条置于力学测试仪，测定最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量。结果PEG组去细胞百分率为95．32％．去细胞猪带瓣管道组织中看不到细胞成分；且细胞外基质（ECM）结构保存完整，胶原纤维排列整齐．无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑，弹性纤维结构清晰，组织无明显水肿。生物力学检测，与对照组比较最大负荷、最大应力、弹性模量、最大应变等的差异均无显著性意义。结论PEG法去除细胞完全，细胞外基质保存完整，对组织机械性能无明显影响，适于构建组织工程带瓣管道。     

化学去细胞肌肉组织工程支架与大鼠脊髓的生物相容性

目的： 探讨化学去细胞肌肉支架与大鼠脊髓的生物相容性,阐明化学去细胞肌肉作为神经组织工程支架治疗脊髓损伤的优势。方法：将36只成年雄性大鼠随机分成2组：植入组和空白对照组。制备脊髓半横断损伤模型后,造模成功大鼠分别于脊髓缺损处植入化学去细胞肌肉或不做处理。每组6只分别于术后1、2和4周处死取材。免疫组织化学染色观察不同时间点损伤脊髓处的ED-1阳性巨噬细胞。取术后4周切片,Holmes镀银染色观察损伤脊髓的再生轴突,免疫组织化学染色观察损伤脊髓的GFAP阳性星形胶质细胞,碱性磷酸酶组织化学染色观察支架中的再生血管。计数ED-1阳性细胞和再生轴突。结果：空白对照组损伤处无轴突再生;其炎症反应在术后1周时最强,之后逐渐减弱;星形胶质细胞在损伤处或空洞周围呈密集多层排列。而植入组化学去细胞肌肉中再生轴突数为613.17±154.96,再生轴突排列方式规则;其炎症反应趋势与空白组相同,未见异物排斥反应;星形胶质细胞成排平行长入支架;化学去细胞肌肉中血管再生良好。结论：化学去细胞肌肉支架与脊髓具有良好的生物相容性,提示化学去细胞肌肉可作为治疗脊髓损伤的组织工程支架。
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一种新型去细胞猪主动脉支架的构建和评价

目的:探索超声波联合曲拉通X-100制备猪升主动脉去细胞支架的方法及效果.方法:从体重相近的中华实验猪制备新鲜主动脉标本150份,随机分为5组:空白对照组、超声波(90 kW)联合曲拉通X-100组、超声波(135 kW)联合曲拉通X-100组、超声波(180 kW)联合曲拉通X-100组和曲拉通X-100组,通过组织学及电镜观察、生物力学性能测定、免疫组织化学法检测层黏连蛋白和纤维连接蛋白的蛋白表达变化等方法,分析比较各组去细胞的效果.结果:超声波联合曲拉通X-100组可完全去除动脉内膜细胞,组织形态、生物力学性能等保持良好,层黏连蛋白和纤维连接蛋白的保存明显优于传统的化学去细胞方法.结论:超声波联合曲拉通X-100组去细胞效果优于传统化学去污剂,是理想的制备猪动脉去细胞支架的方法.     

人肝组织脱细胞支架的制备

目的探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织,经反复冻融,0.01% SDS、
0.1% SDS和1% Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架,并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种
植于脱细胞支架内进行培养。结果HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留,残余DNA检测为
25.3±14.6 ng/mg干质量,小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白
成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖,并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱
细胞支架的制备是可行的,且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。
     

PLGA新型纳米支架的制备及其生物相容性

目的探讨和比较应用不同参数静电纺丝技术制备复合型聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA]纳米纤维缓释膜片的可行性,检测其表面特性以及生物相容性。方法使用不同参数制备纳米纤维膜,扫描电镜观察膜片表面形态;人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPLDCs)培养及鉴定后接种于空白膜上,扫描电镜观察细胞与膜的附着情况,以MTT[3-(4,5-dimethylthiaozol-2-yl)-2,5-dip henyltetrazolium bromide]实验检测不同浓度材料浸提液对细胞增殖变化情况的影响。结果随着PLGA流量增加,纳米纤维直径增加;细胞与PLGA膜复合后粘附良好且增殖状态无明显变化;不同浓度材料浸提液对牙周膜细胞增殖的影响无明显差异。结论通过不同参数静电纺丝制备的新型纳米纤维膜具有良好的生物相容性,可进一步作为多种药物及细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于引导性牙周组织再生(guided tissue regeneration,GTR)或者牙周组织工程。     

一种新型肝组织工程支架的制备及生物相容性评价

目的:构建一种新型肝组织工程支架,并对其生物相容性进行评价,探讨其作为肝组织工程支架的可行性.方法:选用壳聚糖及明胶材料,通过微制造技术制备一种新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架,并与大鼠原代肝细胞共培养,采用HE染色、扫描电镜、MTT法及肝细胞功能学指标等多种检测方法,对支架的细胞毒性及生物相容性进行评价.结果:成功制备了一种新型壳聚糖/明胶复合肝组织工程支架,其孔隙率高、表面积大,有利于肝细胞的黏附与生长,种植在新型壳聚糖/明胶肝组织工程支架上的肝细胞呈现良好的生长增殖趋势,保持良好的生理功能,新制备的支架呈缓慢匀速降解,保持良好的空间结构.结论:制备的壳聚糖/明胶肝组织工程支架具有良好的生物相容性及低细胞毒性,满足肝组织工程的要求.     

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料,为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理．使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性,通过种植内皮和平滑肌细胞,分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低;经该法处理后,血管的细胞成分完全去除,胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留,组织结构完整,内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长,形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法．可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架．适于构建组织工程血管。     

锂掺杂聚癸二酸甘油酯复合支架的制备及其性能

目的：利用锂（Li）离子的特异性作用及聚癸二酸甘油酯（PGS）优良的性能制备PGS-Li复合支架,为其作为牙骨质组织工程支架的应用提供依据。方法：将支架分为2组,PGS交联过程中加入磷酸锂后制备的PGS-Li组和等比例PGS与甘油重结晶纯化后合成的PGS组。凝胶渗透色谱法测定2组支架的相对分子质量,傅里叶红外光谱仪分析2组支架的结构,扫描电子显微镜观察2组支架的表面形态并测定2组支架的孔隙率及孔径,X射线光电子能谱（XPS）仪及电感耦合等离子体发射光谱仪测定2组支架的Li离子含量,热重分析仪分析2组支架的热稳定性,接触角测量仪比较2组支架的亲水性,体外失重实验测定2组支架的降解率。将OCCM-30细胞分为PGS-Li组（加入PGS-Li支架浸提液）、PGS组（加入PGS支架浸提液）及空白对照组（加入空白培养液）,MTT法检测不同时间（24、48和72h）各组细胞的增殖活性,钙黄素-AM染色观察细胞形态。结果：凝胶渗透色谱,PGS-Li组支架的相对分子质量略大于PGS组支架。傅里叶红外光谱检测,PGS-Li组支架出现了磷酸根特异性吸收峰。扫描电子显微镜下观察,2组支架均呈无规则的三维网状结构,孔径为20~160μm,PGS组支架的孔隙率为（53.92±2.18）%,PGS-Li组支架的孔隙率为（53.58±1.73）%,2组支架孔隙率比较差异无统计学意义（P>0.05）。XPS检测,PGS-Li组支架的XPS在54.9eV处出现了与Li 1s相符的峰值,电感耦合等离子体发射光谱仪测试PGS-Li组支架中Li离子含量为0.084%。热重分析,PGS-Li组支架的起始失重温度高于PGS组支架,而停止失重的温度则低于PGS组支架。接触角测量,2组支架均为亲水性材料,PGS组支架材料的接触角为78.26°±2.00°,PGS-Li组支架材料的接触角为69.78°±1.15°,2组比较差异有统计学意义（P<0.05）。体外降解实验,PGS-Li组支架的降解速率快于PGS组。PGS-Li组OCCM-30细胞增殖活性与PGS组和空白对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。钙黄绿素-AM染色后PGS组和PGA-Li组OCCM-30细胞均呈现绿色荧光,细胞形态无明显差异。结论：PGS-Li支架与PGS支架有着相似的组成和结构,且在亲水性及热稳定性方面有着更优异的性能,对成牙骨质细胞增殖无影响,在牙骨质组织工程中有着广阔的应用前景。     

具有活性的同种生物静脉脱细胞支架的制备

目的制备同种异体、无免疫排斥反应的脱细胞生物支架材料,并建立相应的技术方法,为体外构建组织工程胆管提供实验准备。方法选取新鲜具有活性的同种生物静脉作为实验材料,用含0.03%十二烷基硫酸钠(SDS)的Tris低渗缓冲液,以改进的BOOTH法脱去静脉壁的内皮细胞,保留细胞外基质。固定剂固定制成的脱细胞支架,分别行HE染色、胶原纤维染色的光镜和扫描电镜观察、摄片,了解脱细胞支架的形态学和组织学特征并做处理前后的比较。将支架材料进行同种异体间动物皮下接种,结合不同生长因子局部一次性滴入(空白组,bFGF组,VEGF组,bFGF VEGF组),2周后取出支架,进行免疫组化血管染色(8因子),观察支架新生血管的长入情况。结果用质量浓度为0.03%SDS的Tris低渗缓冲液与静脉壁共同孵育48h后,既完全脱去了静脉壁内膜表面的内皮细胞,又较完整地保留了胶原纤维等细胞外基质主要成分,基质主要成分的形态学结构在脱细胞前后无明显改变。皮下植入的异体支架局部未见明显排斥反应,2周后支架内新生血管有不同程度的长入,以滴入bFGF VEGF组新生血管长入最显著。结论质量浓度为0.03%的SDS的低渗缓冲液对制备脱细胞的同种生物支架效果较佳,既能完全脱去静脉壁内膜表面可引起免疫排斥反应的内皮细胞,又能较完整地保留能维持支架形态的胶原纤维等细胞外基质主要成分;所制备的脱细胞支架异体植入无排斥反应,bFGF和VEGF的局部使用可促进新生血管在支架内的生长,有助于支架的远期存活;该实验所制备的静脉脱细胞支架可望在组织工程胆管体外构建的研究中应用。     

家猪脱髓核细胞基质的制备及其生物相容性评价

目的:制备家猪脱髓核细胞基质并评价其生物相容性。方法:分离家猪脊柱髓核组织,并逐步经过胰酶、核酶及TritonX-100处理,得到脱髓核细胞基质,DAPI染色观察脱细胞效果及扫描电镜观察脱髓核细胞基质的物理形态特点,将脱髓核细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜,将大鼠骨髓间充质干细胞接种于基质膜上培养。在第1～5天采用CCK-8检测骨髓间充质干细胞在脱髓核细胞基质膜上的增殖情况,并计算细胞相对增殖率(RGR)来评价其生物相容性。结果:制备出的家猪脱髓核细胞基质肉眼呈白色糜状,DAPI染色发现无细胞残留。扫描电镜下观察发现,脱髓核细胞基质由无序排列的胶原纤维组成。通过CCK-8检测,5 d内细胞毒性分级在0级与2级之间。结论:家猪正常髓核组织能够进行脱细胞处理,且脱细胞后由无序的胶原纤维组成。脱髓核细胞基质具有很好的生物相容性,符合生物工程支架选材标准。